多图介绍Nature重大成果：超越CRISPR、修正89%的人类遗传病的新技术

　　

与流行的CRISPR-Cas9系统（如图）相比，一种名为prime editing的新基因编辑工具可以提供更高的精度和对DNA编辑的控制（如图）。图片来源：Juan Gaertner / SPL

CRISPR–Cas9基因编辑工具备受关注，虽然这种技术可以轻松地改变基因组，但它仍然有时容易出错，或者产生意想不到的影响。现在，最近开发的替代方法可以更好地控制基因组编辑，这对于开发基因疗法可能尤其重要。

Broad研究所刘如谦（David R. Liu）教授在10月21日Nature杂志发表题为“Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA”的研究论文，开发了一种全新的精准基因编辑工具——先导编辑（Prime Editor），这种方法融合了工程逆转录酶和Cas9，将新的遗传信息直接写入到靶向DNA位点，从而使用Prime编辑导向RNA进行编辑。

作者表示，这种方法可以降低“脱靶”效应，这是标准CRISPR–Cas9系统某些应用面临的主要挑战，从而带来更安全的基因疗法。

目前，DSBs刺激的同源性定向修复（HDR）已被广泛用于精确的DNA编辑。但是，HDR依赖于外源供体DNA修复模板，通常会通过DSB的末端修复产生过量的indel，并且在大多数治疗相关的细胞类型（T细胞和某些干细胞是重要的例外）中效率低下。虽然提高DSB介导的编辑的效率和精度仍然是有前途的工作的重点，但这些挑战促使人们探索替代的精确基因组编辑策略。

2016年，David Liu实验室等处开始了不依赖于DNA链断裂的基因编辑技术的研究，其实“不依赖于DNA链断裂的基因编辑技术”就是单碱基基因编辑技术。David Liu实验室基于的是胞嘧啶脱氨酶APOBEC1（能催化C脱氨基变成U，而U在DNA复制过程中会被识别成T）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI（能防止尿嘧啶糖基化酶将U糖基化引起碱基切除修复）开发了第二代和第三代单碱基编辑系统APOBEC-XTEN-dCas9-UGI （BE2）和APOBEC-XTEN-Cas9n-UGI（BE3）。

碱基编辑可以有效地进行四个碱基转换突变（C→T，G→A，A→G和T→C），而无需在包括哺乳动物在内的许多细胞类型和生物体中使用DSB，但目前无法执行八个转换突变 （C→A，C→G，G→C，G→T，A→C，A→T，T→A和T→G），例如需要从T→A到A→T突变直接纠正镰状细胞病（HBB E6V）的最常见原因。 此外，尚无报道采用无DSB的方法进行靶向缺失，如去除引起Tay-Sachs病（HEXA 1278 + TATC）的4碱基重复，或靶向插入，如需要直接插入3个碱基来纠正最常见的囊性纤维化病因（CFTRΔF508）。

为此，David Liu等人将思路转变了一下，设计了一种特殊的gRNA，也就是pegRNA。与普通的gRNA不同，这种pegRNA不但能够结合想要进行编辑的特定DNA区域，还自带“修改模板”。Cas9-逆转录酶融合蛋白会在pegRNA的引导下，精准地切开一条DNA链，然后根据“修改模板”，合成含有正确序列的DNA。细胞内的DNA修复机制会自动把这段新合成的序列整合进基因组。

研究人员在早期测试中取得了相当大的成功。正如他们在论文中所写的那样，他们“在人类细胞中完成了超过175次编辑，包括目标插入，缺失和所有12种类型的点突变，而无需双链断裂或供体DNA模板。”

研究显示了4种人类细胞系，以及有丝分裂后的小鼠皮层神经元原神经“以不同的效率证实了prime editing。”“我们还没有在哺乳动物细胞中发现其它能像是这种具有多功能性和精确度的技术，”David Liu等几位相关科学家对研究发表了声明。

文章第一作者Andrew Anzalone说：“随着我们开发的这项技术越来越多的应用，这项技术的多功能性很快受到瞩目。” “我们可以将新的遗传信息直接复制到靶标位点，我们真的很兴奋。”

Nature杂志评论这一技术是“超精确的新型基因编辑工具”，Science 杂志评论它是“超越CRISPR”的重大突破，哈佛大学教授George Church盛赞这一成果：“朝着正确方向迈出的一大步”。

原文标题：

A. Anzalone et al., “Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA,” Nature, doi:10.1038/s41586-019-1711-4, 2019.