Nature子刊：m6A表观遗传修饰调控骨质疏松症的新机制

来自四川大学华西口腔医院，中山大学附属第一医院的研究人员发表了题为“Mettl3-mediated m6A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis”的文章，揭示了m6A表观遗传修饰调控骨髓间充质干细胞和骨质疏松症的新机制，以及Mettl3在其中扮演的作用，这提出了骨骼健康和病理过程中的表观转录新见解。

　　

来自四川大学华西口腔医院，中山大学附属第一医院的研究人员发表了题为“Mettl3-mediated m6A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis”的文章，揭示了m6A表观遗传修饰调控骨髓间充质干细胞和骨质疏松症的新机制，以及Mettl3在其中扮演的作用，这提出了骨骼健康和患病过程中的表观转录新见解。

这一研究成果公布在Nature communications杂志上，文章的通讯作者为华西口腔医院的袁泉教授，周学东教授，以及中山大学附属第一医院的林水宾教授。

摘要：

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)是真核生物中最丰富的表观遗传修饰，对于哺乳动物发育和疾病控制期间的多RNA加工事件是必需的。

在这篇文章中，研究人员发现小鼠模型中，骨髓间充质干细胞（MSCs）中m6A甲基转移酶Mettl3条件性敲除会带来骨质疏松症的病理学特征。Mettl3功能丧失会导致骨形成受损，成骨分化能力不足和骨髓肥胖增加。

此外，MSCs中的Mettl3过表达也能保护小鼠免受雌激素缺乏引起的骨质疏松症。通过机制研究，研究人员确定了PTH（甲状旁腺激素）/ Pth1r（甲状旁腺激素受体-1）信号轴是MSC中m6A调节的重要下游途径。Mettl3的敲除降低了MSCs谱系Pth1r的翻译效率，并破坏了体内PTH诱导的成骨和脂肪形成反应。

这一研究结果证明了m6A在MSCs中发生错误调节所带来的病理学结果，并揭示了骨骼健康和患病过程中的新型表观转录机制。

背景介绍

骨髓间充质干细胞（MSC）是成骨细胞和骨髓脂肪细胞的常见祖细胞。骨髓间充质干细胞的成骨和成脂分化之间的相互平衡能确保在严格的时空控制下保护骨骼健康。衰老相关的骨质疏松症具有骨量低和骨髓环境中脂肪组织过多积累的特点。在衰老或其他病理刺激如激素紊乱下，骨髓MSCs优先向脂肪细胞分化，导致骨髓肥胖和进行性骨丢失。骨结构的这些改变导致骨骼脆性增加和骨折易感性。然而，MSCs的谱系分配为何有利于脂肪形成至成骨谱系的明确机制仍不清楚。

m6A是最常见的转录后内部mRNA修饰，调节各种生物过程。在哺乳动物中，m6A由甲基转移酶复合物催化，该复合物由酶促亚基METTL，底物识别亚基METTL1和调节亚基WTAP组成，并且它可以被去甲基化酶FTO和ALKBH5擦除。在分子水平上，m6A标记动态安装并从其受调节的转录本中移除，以调整RNA代谢，包括选择性剪接，RNA稳定性和翻译，以响应正常细胞过程中或在压力或疾病期间的多种信号提示。m6A甲基化转录物表达的改变随后影响其存活细胞的细胞功能，确定细胞命运。

最近的体内研究在破译m6A在哺乳动物发育中的参与方式上取得了重大突破。研究发现Mettl3和/或Mettl14缺陷导致的异常m6A水平，减弱了细胞周期进程，破坏了功能性干细胞的正常谱系定型和分化，导致神经发生迟缓，免疫缺陷和不育。鉴于m6A与健康和疾病的强烈相关性，研究人员希望能探索m6A在骨稳态中的潜在参与。

在这篇文章中，研究人员首先利用CRISPR-Cas9技术构建了MSCs有条件的敲除和敲入Mettl3的模型小鼠，然后微型CT和染色显示敲除后导致低骨量和高骨髓脂肪，并且MSCs中m6A整体甲基化水平也有所降低；同时，与执行了卵巢切除术的模型鼠相比，Mettl3过表达可预防雌激素不足引起的骨质疏松；接下来通过m6A MeRIP-seq和RNA-seq技术发现Mettl3缺失的MSCs存在PTH调控基因表达的全局下调，提示PTH/Pth1r信号轴可能是Mettl3介导的m6A甲基化对MSCs命运的影响通路。PTH间歇性注射实验也是印证了m6A通过调节PTH/Pth1r信号轴影响MSCs的成骨和脂肪分化的结论。另外，Pth1r的过表达可以在很大程度上逆转MSCs向脂肪细胞的倾斜分化，改善成骨，进一步证实了PTH/Pth1r信号通路是mettl3介导的m6A修饰控制MSCs谱系分配的新机制。

研究结果
MSCs中Mettl3的敲除可导致低骨量、高骨髓脂肪
利用CRISPR-Cas9技术构建了MSCs有条件的敲除Mettl3的模型小鼠，股骨石蜡切片免疫染色和WB验证了Mettl3的敲除是的成功的。结果显示Mettl3敲除小鼠与对照组相比，骨质量损失且骨髓脂肪组织积聚显著，其骨骼特征与骨质疏松症的病理表型相似。同时LC-MS/MS检测发现MSCs中m6A甲基化整体水平下降。

MSCs中Mettl3的缺失导致成骨潜能降低和脂肪分化增加
接下来，从Mettl3敲除的小鼠中分离出MSCs以验证其体外成骨和成脂潜能。碱性磷酸酶染色活性减弱，钙化减少，并且成骨标志物Runx2, Sp7, Alp和 Bglap 表达下调，表明缺失的MSCs成骨能力不强。相反，油红O染色强度的增加和显著的高表达是脂肪形成的潜在因素，包括Pparγ, Cebpα, Adipoq, Plin1和 CD36。

Mettl3过表达可预防雌激素不足引起的骨质疏松
为了印证Mettl3过表达是否能够增强骨骼健康或预防骨骼疾病，在这里构建了MSCs中有条件的敲入Mettl3，使其在MSCs中过表达。通过卵巢切除术建立骨质疏松症实验模型，与对照相比Mettl3过表达增加了卵巢切除术后小鼠成骨细胞数量，但不影响破骨细胞活性。H&E染色和组织形态学分析显示，去卵巢的对照组小鼠骨髓脂肪细胞过度积累，而去卵巢的Mettl3敲入小鼠骨髓脂肪细胞的增加较小。

m6A调控甲状旁腺激素受体-1（Pth1r）的翻译
通过m6A MeRIP-seq技术对MSCs中m6A具体情况进行分析，结果显示m6A峰主要位于CDS和3’UTR区，并且主要位于终止密码子附近。还发现Pth1r是MSCs和成骨细胞前体中谱系分配的关键调控因子，在其翻译终止密码子附近具有高富集和特异性的m6A峰。RNA-seq发现Mettl3缺失的MSCs存在甲状旁腺激素（PTH）调控基因表达的全局下调，提示PTH/Pth1r信号轴可能是Mettl3介导的m6A甲基化对MSCs命运的影响通路。

m6A对于PTH功能是必不可少的
Mettl3敲除的小鼠经PTH处理后骨重塑未见明显增强，证实敲除Mettl3可减弱PTH诱导的成骨作用。PTH除了在成骨过程中显著富集外，还能抑制脂肪细胞分化，促进骨形成。PTH间歇性注射显著降低了Mettl3敲除小鼠体内MAT的积累，但很难逆转Mettl3缺失小鼠中较高的骨髓脂肪含量；Pth1r过表达改善了m6A还原引起的油红O染色强度增加，显著提高ALP活性和钙结节形成。Pth1r的过表达可以在很大程度上逆转MSCs向脂肪细胞的倾斜分化，改善成骨，进一步证实了PTH/Pth1r信号通路是mettl3介导的m6A修饰控制MSCs谱系分配的新机制。

讨论
Mettl3介导的真核生物m6A RNA甲基化修饰对稳定体内稳态具有广泛的功能影响，而m6A水平的任何扰动都可能导致功能障碍或疾病。在这里研究证实了骨髓间充质干细胞中Mettl3的缺失破坏了小鼠的细胞命运，导致骨质疏松症病理表型如成骨潜能不全的骨量减少、成骨潜能增强的骨髓脂肪增多等，揭示了m6A对骨髓间充质干细胞的有效特异性调控。此外，Mettl3功能的增加可以预防雌激素不足引起的绝经后骨质疏松症，确立了Mettl3在确定骨髓MSC命运中不可或缺的作用，从而保证骨骼健康。早期骨髓间充质干细胞中m6A表观遗传修饰的减少抑制哺乳动物Pth1r的翻译，并在骨积累过程中阻断其对PTH的合成反应。这些功能缺陷使MSC微妙的分化平衡向脂肪谱系倾斜，导致严重的骨质流失和过度的MAT堆积。实验数据丰富了m6A调控干细胞分化的证据，揭示了调控不当的m6A修饰与骨病理障碍之间的功能联系，从而为骨质疏松症治疗新策略的开发提供了可能。

原文标题：

Mettl3-mediated m6A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis