外泌体和生命现象之二：外泌体蛋白质组解析

　　

公益基金会癌症研究小组 植田 幸嗣

　　外泌体是一种微分泌囊泡。它是细胞内囊泡转运的产物之一，具有将不需要的分子释放出细胞外并将内含分子运输和传递到远端细胞的功能。通常，外泌体具有直径为几十至一百纳米的脂质双分子层结构，与细胞结构成分相比，特定蛋白质组（四次跨膜蛋白超家族，Rab家族，Tsg101，Alix等）和miRNA的含量特别多。然而，有研究结果指出，通过细分粒径进行组学分析时，发现特定粒径的分子结构明显不同¹），所以目前外泌体的分子生物学定义仍未明确。事实上，有不少研究通过使用各种不同的外泌体提取方法（使用提取纯度不同的外泌体样本）进行的功能分析实验发现，外泌体参与癌症转移、肿瘤浸润、血管新生、免疫细胞调节等现象。

　　事实表明，"致病细胞的分子谱可以从其释放到体液（如外周血等）的外泌体中读取。”以诊断为目的外泌体应用正逐渐商业化。例如，CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）认证实验室推出的检测产品，可从尿液外泌体中同时检测出前列腺癌三种特异性RNA：PCA3 non-coding RNA、ERG mRNA、SPDEF mRNA。并且可以作为LDT（Laboratory Developed Tests：实验室内部研发、验证、使用的体外诊断测试）进行国际委托技术服务²）。此外，该实验室还建立了一项从血浆中一步分离外泌体DNA/RNA及cfDNA（circulating free DNA）的技术，并发表了一项关于检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者血浆中表皮生长因子受体EGFR-T790M突变的研究。该突变导致60％接受EGFR抑制剂治疗的肺癌患者产生耐药性。若出现EGFR突变，就需及时替换Osimertinib等有效药物进行治疗。因此，快速的耐药诊断非常重要。通过对210例EGFR突变肺癌患者的对比试验，目前认可的cfDNA诊断法检测T790M的灵敏度是58%，特异性是80%；而EGFR T790M 检测的灵敏度是92%，特异性是89%。相比之下，EGFR T790M 检测可获得更好的诊断结果³）。

　　在此背景下，无论是基础生物学研究还是临床应用，都需要实验室之间能够零差异再现的高纯度外泌体，一种任何人都能轻松分离和纯化外泌体的工具是不可或缺的。特别是，如果研究对象是从血清和血浆样本中提取纯化的外泌体蛋白，则需要非常高的纯化水平。血清•血浆的蛋白浓度超过60mg/mL，还存在许多高分子量复合物如脂蛋白，即使是外泌体提取常用的超速离心沉淀法，仍然会存在大量血清游离蛋白（IgM，α2 -巨球蛋白，补体成分等）和脂蛋白。因此，通过LC/MS对超速离心法提取的血清蛋白进行全面定量蛋白质组分析时，几乎所有含量都是血清游离蛋白，只检测出了微量的外泌体蛋白⁴。

　　除超速离心法外，外泌体的提取方法还有抗体亲和法、聚合物沉淀法、凝胶过滤法以及从切除的组织浸液中直接回收的方法⁵） 等。MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS（下文称为MagCapture试剂盒）的原理是亲和纯化磷酯酰丝氨酸PS （磷酯酰丝氨酸是构成外泌体膜的脂质之一）。与其它方法相比具有各种各样的优点。固定在磁珠上的Tim-4蛋白与PS在钙离子存在的条件下结合，通过螯合剂洗脱，可以不洗脱非特异性磁珠结合蛋白而特异性洗脱外泌体，因此提取的纯度很高。另外，只要磁珠纯化操作可以顺利进行，就不受样本容量的限制，即使是用稀释的样本也同样有效。此外，由于在没有变性溶解的情况下进行洗脱，后续的粒子计数检测、显微镜检查和细胞给药实验等应用均可放心使用。

　　根据图1A的方法，从相同血清中提取外泌体，并通过Orbitrap Fusion Lumos质谱仪进行综合蛋白质组分析。结果显示，超速离心提取外泌体的总蛋白质鉴定数为612种，MagCapture试剂盒提取外泌体的总蛋白质鉴定数为1,103种，后者是前者的约1.8倍（图1B）。这是因为超速离心法的血清中残留大量的游离蛋白质，掩盖了微量外泌体来源的信号。此外，比较鉴定的蛋白质以及相对定量值，可以看出，MagCapture试剂盒提取的外泌体中，被认为是外泌体标记蛋白的恒定分子组合以及相对含量都要更多（图2）。由此可见，通过试剂盒提取的外泌体纯度远高于现有的超速离心沉淀法。

图1. 提取纯度对外泌体蛋白质组分析的影响
A）通过超速离心沉淀法和MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS提取血清中的外泌体并进行质谱分析
B）鉴定出的蛋白数量和重叠部分

　　使用高纯度的外泌体，有利于阐明外泌体的功能以及探索诊断和治疗药物，使研究结果更具可信度。从外泌体提取的纯度、灵活性、可重复性等方面来看，MagCapture试剂盒适合作为所有外泌体研究的起点。但是，通过该试剂盒回收的产物也是一组含有大量PS膜组分的无限定尺寸的集合，是否等同于其他现有研究指出的外泌体，还需要后期的组学分析来进行仔细评估和定义。随着包括MagCapture试剂盒在内的提取纯化技术以及检测技术的发展，我们期待对外泌体的本质阐明和临床应用的进一步发展。

 
 
图2. 鉴定外泌体蛋白质的定量顶视图
A)   MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS及B)超速离心沉淀法提取血清中外泌体的蛋白质组定量分析结果
B）收集并记录了有报道作为外泌体标记物的蛋白。

◆参考文献
[1] Zhang, H. et al. :"Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation", Nat. Cell Biol., 20, 332（2018）.
[2] McKiernan, J. et al . :"A Novel Urine Exosome Gene Expression Assay to Predict High-grade Prostate Cancer at Initial Biopsy", JAMA. Oncol., 2, 882（2016）.
[3] Castellanos-Rizaldos, E. et al . :"Exosomebased Detection of EGFR T790M in Plasma from Non-Small Cell Lung Cancer Patients", Clin. Cancer Res ., DOI : 10.1158/1078-0432. CCR-17-3369（2018）.
[4] 植田幸嗣：「プロテオーム解析から見たバイ オマーカーとしてのエクソソームとその特 徴」, 細胞工学, 32, 71（2013）.
[5] Jingushi, K. et al. :"Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin", Int. J. Cancer , 142, 607（2018）.

注：该文章来自和光纯药时报Vol.86 No.3 10-11页 『第２回 エクソソームのプロテオーム解析』（译：宝柏·中国）

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