Nature子刊：一种测量能量代谢调节环路的新标记——Brs3

　　

生物通报道：蛙皮素，又称为铃蟾肽，韩蛙皮素，是从蛙皮中分离的一种14个氨基酸的多肽，研究发现蛙皮素受体3（BRS3）作为一种G蛋白偶联受体，可以调节能量稳态和心率。

来自美国NIH美国国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK）的研究人员发表了题为“Brs3 neurons in the mouse dorsomedial hypothalamus regulate body temperature, energy expenditure, and heart rate, but not food intake”的文章，发现背内侧下丘脑（DMH^Brs3）中表达Brs3的神经元一旦突然激活就会导致体温，棕色脂肪组织温度，能量消耗，心率和血压的增加，从而指出Brs3表达是一种测量能量代谢调节环路的潜力标记。

这一研究成果公布在Nature Neuroscience杂志上，由Marc Reitman等人领导完成。

背景

BRS3是一种孤儿G蛋白偶联受体，具有良好的保守性，在特定的大脑区域上大量表达。这种受体所在的G蛋白偶联受体 A家族包括有神经介素B和胃泌素释放肽受体。哺乳动物BRS3缺乏已知的内源性高亲和力配体，并且对蛙皮素具有低亲和力，蛙皮素在哺乳动物中尚未发现。

小鼠靶向敲除Brs3会导致肥胖，这其中涉及能量消耗减少，食物摄入量增加，静息Tb和静息心率降低等。一般认为，BRS3激动剂能增加静息Tb，能量消耗，心率和血压，活性棕色脂肪组织（BAT），减少食物摄入量，目前关于Brs3神经元群体的位置和指导这种生理学的特定环路仍有待探索。

BRS3存在于脑核中，大部分位于下丘脑中。表达Brs3与Tb，能量消耗和食物摄入的调节密切相关，因此可以作为治疗代谢性疾病重要环路的潜力标记。

研究结果

1.Brs3表达模式

为了研究表达Brs3的细胞的功能，研究人员将他莫昔芬诱导Cre重组酶基因靶标插入天然Brs3基因座中，构建了Brs3-2A-CreERT2（Brs3-Cre）小鼠（图1）。同时他们也采用了Cre依赖性tdTomato报道系（Ai14）使Brs3-Cre表达可视化。POA，PVH，DMH，纹状体末端（BNST），内侧后背杏仁核和外侧臂旁核的床核tdTomato +神经元的浓度最高（图1和表1）。而对照组，没有他莫昔芬治疗的则未观察到tdTomato发表达。

原位杂交证明，表达Brs3 mRNA的大多数神经元也表达tdTomato mRNA，反之亦然（图1）。tdTomato表达模式与之前报道的Brs3 mRNA和配体结合一致。由此研究人员得出结论：Brs3-Cre小鼠中的Cre表达忠实地再现了内源性Brs3表达模式。

（图1）

Brs3定位于X染色体上，Brs3Cre会发生X-inactivation，因此这项研究所有后续研究都使用雄性小鼠。接下来研究人员分析了携带Brs3Cre等位基因的小鼠表型。下丘脑Brs3 mRNA表达降低41±3％（图2），与同窝对照相比，Brs3-Cre小鼠的体重，食物摄入，脂肪量和体重略有增加。这一表型表明Brs3Cre等位基因具有降低的BRS3功能。然而，Brs3-Cre小鼠确实通过增加Tb和减少食物摄入来响应选择性BRS3激动剂MK-5046（图2）。 总之，这些数据表明Brs3Cre等位基因属于亚(效)等位基因，而不是无效突变。

2.通过冷暴露，再喂食和瘦素治疗激活Brs3神经元

研究人员分析了Brs3神经元对影响能量稳态的干预措施的反应激活。结果显示冷暴露刺激了dDMH-DHA，内侧视前区（MPA）和中位前区（MnPO）的Brs3神经元中的c-Fos表达，但不影响PVH，腹侧DMH（vDMH）或PBN（图2）。图1A，b）。相反，在PVH（PVHBrs3神经元）和PBN中的Brs3神经元中快速增加的c-Fos表达后重新进食，但在dDMH-DHA，vDMH，MPA或MnPO中没有（图1）。因此，通过冷暴露和重新进食激活Brs3神经元的不同亚组。

Brs3 mRNA富含表达瘦素受体的神经元，因此研究人员分析了瘦素是否激活Brs3神经元。瘦素处理增加了MPA，MnPO，dDMH-DHA和vDMH中Brs3神经元中的STAT3磷酸化，但不增加PVH或PBN（补充图3a，b），表明这些神经元可能被瘦素激活，可能是直接激活。

（图2）

3.DMH^Brs3神经元的光遗传激活增加Tb，心率和血压

DMH^Brs3神经元的光遗传激活能帮助科学家们在不处理小鼠的情况下研究快速的生理反应，这尤其适合复合检测心率和血压。

研究人员用AAV-Flex-ChR2-tdTomato（图4）和对照（AAV-DIO-mCherry）病毒转导DMHBrs3神经元，在离体切片实验中刺激DMH^Brs3神经元中的通道视紫红质-2（ChR2）增加神经元放电（图7）。并且研究人员对清醒小鼠进行了五个周期的研究，其中包括20分钟的光刺激，然后在激光关闭的情况下60分钟（图4）。

结果显示光刺激引发Tb快速强劲的增加，没有对身体活动产生影响。在mCherry +对照小鼠中未观察到对应变化。增加刺激频率产生Tb的剂量依赖性增加（补充图7）。研究人员的标准刺激使用1秒ON，3秒OFF协议（20 Hz，10毫秒脉冲）。将光剂量加倍（1秒ON，1秒OFF）使Tb的初始增加率加倍（图7）。因此，这一标准刺激方案不是最大刺激。

导致Tb增加的主要效应机制是棕色脂肪组织的交感神经活化，以及血管收缩和行为适应。为了研究DMHBrs3光遗传激活对BAT热原的影响，研究人员使用了红外成像。在基线时，TBAT为35.7±0.08℃，腰椎温度（Tlumbar）为34.6±0.09℃。DMH^Brs3神经元的光遗传学刺激使TBAT增加1.36±0.16℃（P = 6.8×10-5）和Tlumbar为1.24±0.15℃（P = 8.9×10-5;图4和图7）。TBAT最初比Tlumbar快1.90±0.18倍。这些结果表明BAT是Tb增加的驱动因素。

（图4）

4.DMH^Brs3→RPa途径增加Tb并接收来自POA和其他核的输入

研究人员利用AAV-DIO-synaptophysin-mCherry追踪了DMH^Brs3神经元。他们发现DMH^Brs3神经元投射到腹外侧导水管周围灰质（vlPAG），伏隔核，蓝斑和尾部但不是延髓头端腹外侧区。其他不太密集的受神经支配的大脑区域包括BNST，丘脑的室旁核和弓状核（弧）。对RPa的DMH投射可刺激BAT，研究人员通过用AAV-Flex-ChR2感染DMH细胞体，并对RPa进行光刺激来测试DMH^Brs3→RPa投射增加Tb的能力。

结果显示，刺激DMH^Brs3→RPa末端使Tb增加0.43±0.12℃（P = 0.006），对体力活动没有影响，并且对mCherry对照中的Tb或活性没有影响（图5）。因此，选择性激活DMH^Brs3→RPa途径足以增加Tb，最有可能通过谷氨酸能预测。实际上，DMH^Brs3→RPa神经元很少表达Gad2（2.6±0.5％），这是位于后弧的标记（尾至前囟-2.06 mm）。在髓质中，研究人员在孤束核和延髓头端腹外侧区中稀疏的GFP神经元。为了评估从视前区到DMH^Brs3→RPa神经元的神经递质输入，研究人员进行了ChR2辅助电路映射。他们用AAV-ChR2-EYFP转染POA神经元，并使用注射在RPa中的HSV-lsl-mCherry识别DMH^Brs3→RPa神经元。自此，研究人员发现记录的大多数DMH^Brs3→RPa神经元接受来自POA的GABA能和谷氨酸能输入（图7）。这表明DMH^Brs3→RPa电路受到POA的动态调控。

（图7）

结论

遗传和药理实验证明了BRS3在控制Tb，能量消耗，食物摄入和心率方面的作用。研究人员分析了其中起作用的神经元，结果发现DMH^Brs3神经元调节Tb，能量支出和心率，同时不影响食物摄入或身体活动。更具体地说，DMH^Brs3神经元通过DMH^Brs3→RPa途径双向控制Tb，包括对BAT的作用。相反，PVH^Brs3神经元控制食物摄入，不影响Tb，能量消耗或身体活动。

这些结果指出了Brs3敲除小鼠表型的机制基础。DMH^Brs3神经元失去BRS3可以有助于减少静息Tb，能量消耗和心率。PVH^Brs3神经元中BRS3的缺失可促进食物摄入量的增加。总之，这些机制有助于解释全球泛滥的肥胖问题。

尽管这个模型很简单，但需要注意的是遗传Brs3消融仅消除一种受体，而光遗传学和化学操作操作探测表达该受体的神经元的特性。目前的研究并没有解决BRS3在神经元中的作用。

其他方面也可能有助于调节Tb，能量消耗，心率和食物摄入量。例如，研究人员观察到PBN^Brs3神经元在再喂食期间被激活，这可能表明其在调节食物摄入或信号营养状态中的作用。类似地，冷环境激活MPA^Brs3和MnPO^Brs3神经元表明这些类型都有助于调节产热。

研究数据表明DMH^Brs3→RPa神经元受GABA能和谷氨酸能视前神经元的调节。这还需要进一步的研究来确定哪些POA神经元为DMH^Brs3→RPa神经元提供抑制和兴奋性输入。总之，这些研究已经确定了两个具有单独功能的Brs3种群：PVH^Brs3神经元可以在不影响Tb的情况下稳定地调节食物摄入。DMH^Brs3神经元调节Tb，能量消耗，BAT活动，心率和血压，对食物摄入或身体活动没有影响。这些数据表明存在专门用于产热的DMH^Brs3→RPa群体。Brs3也可以作为一种神经元标记，用于解剖控制能量稳态的神经回路。

（生物通）

原文标题：

Brs3 neurons in the mouse dorsomedial hypothalamus regulate body temperature, energy expenditure, and heart rate, but not food intake

https://www.nature.com/articles/s41593-018-0249-3