《Cell》CRISPR关键论文受质疑 17个实验室提出效率问题

来自17个实验室的研究人员报告了CRISPR这种流行技术的效率问题。

　　

生物通报道：由全球17个实验室组成的一个研究团队公布了最新研究成果，针对一项高引用论文提出质疑，原始论文报道了热门技术：CRISPR的条件性敲除小鼠平台，而9月1日发布在bioRxiv上的预印论文指出，实际上这种技术的效率低得多。

2013年，Whitehead生物医学研究所的遗传学家Rudolf Jaenisch利用CRISPR/Cas，构建出了带有条件性等位基因的小鼠，以及携带着多个标记基因能够报告这些基因是否正在表达的小鼠。这开辟了新的研究途径，大大加快构建基因修饰动物的速度。

这篇题为“One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering”的论文被引近1000次，是全球许多实验室进行CRISPR研究的参考文献。

而最新研究则指出了原始研究的局限性，认为其成功似乎是由于删除了杂合小鼠品系内的一种特定基因。

“最初的Jaenisch论文是一个里程碑，”康奈尔大学干细胞和转基因中心主任遗传学家John Schimenti（未参与相关研究）说， “它证明了你可以在特定的位点获得高效率和高效率的诱变。”

有条件的敲除小鼠在生物医学研究中非常重要，因为它们能让科学家在生物体特定组织以及在发育过程中的特定时间删除必需基因。在此之前，科学家们构建这样的模式生物需要利用胚胎干细胞(ESCs)，且要经历一个复杂且耗时的过程。

Jaenisch提出的方法很有前景，但试图使用这种技术生成小鼠的研究并没有那么成功。“所有试图通过他们最初提出的方法制作floxed等位基因的人都遭遇了失败，”Schimenti说。

Schimenti指出，Jaenisch方法通常会导致脱靶突变，缺失或无法以正确的方向插入两个LoxP位点。“这一点其实被科学界普遍认可”。

因此，来自澳大利亚国立大学的Gaetan Burgio等人希望能弄清楚到底是怎么一回事。

首先，有三个研究组在不同的小鼠品系中复制了针对同一基因的原始实验，但没有成功。之后，包括这三个研究组在内的17个实验室在5个不同小鼠品系，针对小鼠基因组中共56个基因和2个基因间区域独立地重复实验。

这些实验室共完成了17,887个显微注射/电穿孔小鼠受精卵，1718只活小鼠实验，其中只有15只具有条件对照所需的插入LoxP位点。在所有测试的小鼠中，出现了脱靶缺失或突变，而不是LoxP位点的正确插入。

与原始研究中小鼠获得条件性敲除等位基因的16％效率相比，Burgio和其他人的成功率仅为0.87％。

“这种方法的成功率。 。 。相当于胚胎干细胞的经典方法，“Burgio说。

复制研究小组也希望能找出导致成功条件性敲除小鼠的可能因素，他们发现同时插入两个LoxP位点对于该技术的成功至关重要。

Jaenisch认为这两项研究中使用的小鼠品系之间的差异是一个问题，这也是两项研究之间差异很大的根本原因。“我认为这些数据有问题，”Jaenisch说，他不赞同最新研究的成果发现。

Schimenti也表示同意在复制原始研究时应考虑遗传背景。“我认为这是bioRxiv研究中的一个缺陷，如果是检测Jaenisch的研究结果，就应该使用完全相同类型的动物。”

不过，Burgio和Schimenti也都指出，Jaenisch论文中采用的小鼠品系其实并不是常用的品系。

Schimenti还提出了原始论文的16％成功率可能代表该研究中使用特定小鼠品种中单个基因座的可能性。 “我认为很明显这是一个非常有问题的技术，”Schimenti说。 “还需要提出一个应对方法。”

（生物通：万纹）

原文标题：

Re-Evaluating One-step Generation of Mice Carrying Conditional Alleles by CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing Technology

One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering