YTHDF2介导mRNA降解导致子代斑马鱼发育迟缓 | 案例解析

　　

标题：m6A-dependent maternal mRNA clearance facilitates zebrafish maternal-to-zygotic transition
日期：2017年2月
杂志：Nature
IF：40.1
机构：美国芝加哥大学何川课题组

1.摘要

在胚胎发育早期，由母本→合子过渡（maternal-to-zygotic, MZT）是一个十分重要的过程。然而在大部分脊椎动物体内，MZT的时序是如何被塑造的其机制目前仍然未知。在哺乳动物发育早期，胚胎中来自母源mRNA会产生大量的蛋白。一旦度过MZT后，胚胎的基因组会被激活，而YTHDF2会将母源mRNA进行清除。来自芝加哥大学的何川教授课题组发现，胚胎中超过三分之一的母源mRNA上存在m6A修饰，这些mRNA之后会被YTHDF2清除。YTHDF2一旦被敲除后，带有m6A修饰的母源mRNA半衰期显著上升，合子基因组激活受阻。这些胚胎无法及时启动MZT，细胞周期发生中止从而导致斑马鱼子代发育延缓。

2．正文

 

在斑马鱼胚胎发育的早期，YTHDF2几乎处于一个高表达的状态，作者使用TALEN技术对YTHDF2进行了敲除。转录组测序结果表明YTHDF2纯合突变，在胚胎期表达量始终低于野生型。

 

作者将杂合突变+/-的雄鱼和雌鱼进行交配后，发现纯合突变的F1代发育正常。

 

作者对纯合突变的F1代进行交配，发现超过97%的F2代mid-blastula transition（MBT）延缓，超过70%的F2代均发育异常，不能跨过胚胎发育的第一个阶段。这种强致死作用可能是雄鱼有缺陷的精子造成的。为了鉴定母源YTHDF2的功能，作者将纯合突变雌鱼与野生型雄鱼进行交配。

作者对纯合突变的胚胎和野生型胚胎整个发育周期进行观察后发现，YTHDF2野生型胚胎在受精后3.7小时（hpf）后仅仅20分钟就开始呈椭圆形，而YTHDF2纯合突变则需要足足45分钟且细胞分裂持续进行。在7hpf需要开始形成原肠胚售时，突变胚胎用于发育pseudo-sphere和pseudo-50% epiboly少了约半小时（相对于野生型的5h.p.f）。原肠胚发育在纯合突变胚胎中至少被推迟了发育阶段的第一个30小时。YTHDF2补救实验表明，当向胚胎中注射YTHDF2，上述症状会恢复。所有结果都证实胚胎发育一些表型缺失现象由YTHDF2引起。

  

作者对YTHDF2突变型胚胎和野生型胚胎中MBT前后DNA总量进行检测发现，突变型中DNA总量显著低于野生型，这表明这段时间内细胞分裂事件较少。在细胞分裂中期和后期，突变型中缺少可识别的PH3蛋白。人为注射YTHDF2进行补救后，以上症状恢复，表明YTHDF2突变后细胞会在G2晚期或M早期停滞。所有结果均证实YTHDF2在MZT期间，对细胞的正常发育至关重要。

作者对胚胎发育的5个hpf阶段进行了转录组测序，将表达的转录本分为三个大类即母源maternal、半稳定semistable和合子zygotic，又根据时间前后分为early和late。紧接着又使用m6A-seq和miCLIP-seq，胚胎发育期5个hpf阶段mRNA上碱基m6A修饰水平进行了高分辨率鉴定并取交集。超过40%的转录本上有m6A peak，超过36%的母源mRNA被m6A修饰。母源mRNA在4hpf后显著降低，同时mRNA整体m6A修饰水平也是逐渐降低。在MZT期间，发生m6A修饰的转录本整体数量上维持一个很高的水平，而m6A修饰水平在此期间会有波动。RRACH motif在起始密码子和终止密码子附近显著富集。下一步，作者将母源转录本分为甲基化和非甲基化两类。与非甲基化转录本相比，发生甲基化转录本在4hpf前一直维持较高水平，之后表达水平逐渐降低。功能富集分析显示这些转录本主要集中在磷代谢相关如ATP-binding以及cell cycle regulation functions等。而那些非甲基化转录本的功能主要富集在氮代谢。

 

作者对YTHDF2纯合突变和野生胚胎在5个时间点进行了转录组测序。差异分析结果表明MBT 4hpf时转录本差异最大。由于YTHDF2缺失导致母源mRNA显著上调，而野生型胚胎中4hpf时mRNA含量显著下降。下一步作者采用了mRNA翻译抑制剂MO模拟YTHDF2基因功能缺失。转录组数据表明，其结果与YTHDF2基因功能缺失产生的现象很相似。这些结果都证实YTHDF2有助于在胚胎中清除母源mRNA，该基因如果发生功能缺失会导致胚胎基因组激活受阻。

  

由于在4hpf时，纯合突变的胚胎中mRNA的m6A修饰水平达显著上升了50%。所以作者推测YTHDF2可能在4hpf时开始作用于那些发生甲基化的mRNA。接下来作者分别对YTHDF2纯合突变胚胎和MO处理的胚胎进行了m6A-seq和miCLIP-seq，将显著差异上调的基因中的20%列为候选的YTHDF2靶基因，韦恩图取交集后135个基因标为Most stringent targets。这135个靶基因主要功能富集在磷代谢、细胞周期和生殖等功能上。其中mtus1a、mylipa、setdb1a、vps26a和zgc:162879参与调解细胞周期，而buc和tdrd1主要涉及生殖细胞产生等功能。qPCR实验表明突变胚胎中mRNA相对表达量远远大于野生型胚胎。所以由于YTHDF2缺失导致母源甲基化mRNA在胚胎中保留时间过长从而引起斑马鱼早期发育延缓。

 

 

为了验证带有m6A修饰的mRNA能够激活YTHDF2的清除功能，作者将GFP荧光蛋白mRNA（分别带有和不带有m6A修饰）注射进入胚胎细胞中并用qPCR验证。结果表明，在野生型胚胎中带有m6A修饰的mRNA被降解的速度更快，在YTHDF2突变型胚胎中，发生m6A修饰的mRNA降解受到影响。相似的实验结果也在MO处理组得到重现。在荧光显微镜下，YTHDF2突变型胚胎中荧光强度显著高于野生型。所有这些结果都表明m6A甲基化会影响靶基因的稳定性，而斑马鱼胚胎中YTHDF2能够直接介导母源mRNA的降解/清除。

在本文最开始的实验中，作者将YTHDF2纯合突变的雄鱼和雌鱼进行交配。产生的子代中存活率约为30%，且这些子代均不含有母源YTHDF2和合子自身表达的YTHDF2。作者进一步证实合子中表达的YTHDF2也能参与母源mRNA降解。但是在胚胎发育早期，YTHDF2似乎只能激活母源mRNA降解而不是合子中的mRNA。

先前已有报道称miR-430介导脱腺苷酸化从而对mRNA进行降解并与YTHDF2高度重叠。YTHDF2先作用于靶基因，紧接着是miR-430。RNA降解时序反应再次表明母源YTHDF2在合子中介导mRNA降解反应，之后miR-430继续“接力”下游的mRNA降解反应。尽管不同分子降解机制有所不同但是miR-430、YTHDF2以及靶基因从时序上来看高度重叠，各种实验结果结合到一起都不遗余力地强有力地证实了机制不同时序相同的不同清楚机制对母源mRNA降解极其重要。