Immunity：Treg细胞识别的天然抗原表位揭示免疫机制

　　

导读
表达Foxp3的调节T（Treg）细胞对于预防自体免疫、抑制抗肿瘤免疫是一种关键的细胞。Treg细胞识别的主要自体抗原仍未确定，成为研究免疫调节的重要障碍。来自芝加哥大学的Leonard等人鉴定了小鼠前列腺中的天然Treg细胞配体，其方法可作为一种策略用于寻找与人类自体免疫病相关的Treg细胞抗原，从而揭示导致自体免疫的机制，和发展性癌症中Treg如何被利用来抑制机体本身的免疫反应。该研究近期发表在顶级免疫学期刊Immunity（IF：24.08）上。Immunity影响因子从前年的19.748升至21.561，今年又达到了 24.082。

背景
免疫系统在响应外来抗原刺激、产生免疫应答的同时，也要限制针对自体抗原的免疫应答。免疫应答过程产生的各种CD4+ T细胞表达独特的T细胞受体（TCR），能特异识别由抗原呈递加工产生的抗原MHC-II复合物；但是需要经过两个关键途径先将其中会与自体反应的那些CD4+ T细胞清除掉，否则产生的自体反应将是非常可怕的。这两个重要的耐受机制就是阴性筛选和调节性T细胞生成，前者能够从常规T细胞库中清除掉能与自体pMHC-II反应的T细胞群或者将其转化为类初始T细胞系，后者通过将一些过度自反应T细胞转化为表达转录因子Foxp3的调节性T细胞（Treg），以抑制那些逃过阴性筛选的自反应T细胞，从而限制对自体组织的应答，维持免疫稳态。

要了解机体如何调控Treg细胞的分化、平衡和抑制活性，就需要鉴别出哪些分子启动胸腺中Treg细胞发育、哪些分子参与Treg细胞在外周环境中识别自体抗原以协调免疫抑制。可惜，胸腺来源的Treg（tTreg）的天然抗原一直未能确定。

找出Treg细胞识别的内源性抗原意义重大。如果找不到这些能启动Treg在胸腺里分化的天然自体抗原，就无法全面认识Treg细胞介导的免疫抑制为何在自体免疫疾病和炎性疾病中失灵，更无法回答在发展性癌症中Treg细胞是如何被利用来抑制机体本来的抗肿瘤免疫性。

如果能找到这些抗原，就能从形态，频率，结构定位和谱库等角度去分析Treg细胞如何响应这些抗原；了解这种识别是否需要特定的生化或者结构特征（而这些信息有助于了解其抑制机制）；有助于清晰阐明为何部分自体反应T细胞被清除掉而部分则被引导转化为Treg细胞系，这种TCR-pMHC-II结合是否会是决定T细胞不同命运的主要因素；以及考虑到机体内潜在如此大量的自体多肽，防止组织遭受自体免疫攻击是否依赖于能与某些特定自体pMHC-II复合物反应的Treg细胞等等。

来自芝加哥大学的研究人员鉴别出了两个前列腺特异Treg细胞克隆所识别的多肽抗原—— 一种Treg细胞在小鼠前列腺肿瘤中大量存在，另一种Treg细胞与前列腺自体免疫损伤相关。巧的是，这两个多肽抗原来自同一个前列腺特异蛋白的不同部位，而这个前列腺特异蛋白在多个小鼠自体免疫病模型中往往是免疫失调中向抗体攻击的靶子。这种关联为深入了解Treg细胞介导的耐受提供了线索，其研究策略可作为一种参考策略用于鉴别其他的人和小鼠Treg细胞识别的抗原。

可作为一种策略的研究方法
研究人员最初把目标锁定在此前研究中发现的小鼠前列腺损伤自然产生的Treg细胞克隆MJ23，想方设法鉴别出其识别的pMHC-II配体中对应的那个未知抗原。

怎么分析这些蛋白呢？研究人员设计了一种抗原活性筛选方法：建立表达MJ23 TCR受体的转基因T细胞（MJ23tg T细胞），用体外培养系统来监测其增殖活性。用这个方法，研究人员发现将前列腺背外侧叶蛋白提取物与脾源树突状细胞（splenic dendritic cells）共培养后，能够诱导MJ23tg T细胞的增殖，说明MJ23相关肽能够被分离，并用这个方法监测到。

这个未知抗原（姑且称为MJ23相关肽抗原）的MHC-II复合物是通过与MJ23 TCR受体作用，以自体免疫调节因子（Aire）依赖的方式启动胸腺里的Treg细胞发育。通过各种考据分析，研究人员推测这个MJ23肽抗原应该满足3个标准：包含该肽段的蛋白应该主要在前列腺表达；在髓质胸腺上皮细胞中编码该蛋白的基因应该是Aire的一个转录靶标；该基因不在Y染色体上（因为在雌性小鼠中MJ23tg Treg细胞同样发生这种分化）。通过转录图谱分析，研究人员筛选出满足上述条件的20个潜在基因，并在昆虫细胞中表达这些蛋白。

将培养的树突状细胞与上述表达的蛋白共培养，发现其中TRPM8通路相关因子3(Tcaf3，也叫Eapa2或者Fam115e)能够在体外强烈诱导刺激MJ23tg T细胞。这种刺激能够被抗MHC-II阻断抗体所阻断，且Tcaf3不会诱导无关类型的转基因T细胞。用重组Tcaf3免疫注射活体小鼠能引发MJ23tg T细胞的强烈增殖，说明Tcaf3来源的肽段能够在活体内被有效地加工呈递。通过肽段分析能与这些小鼠内唯一功能性MHC-II蛋白I-A（b）结合的肽段，最后确定出Tcaf3的646-658肽段为被MJ23tg T细胞识别的肽段表位。

关键实验
但是我们知道，体外实验结果跟体内并非一回事儿，特别是免疫学研究，体外实验无法模拟复杂的活体免疫反应，活体动物实验才是“检验真理的唯一标准”。

所以芝加哥大学的研究人员委托赛业生物公司制备了Tcaf3（646–658）13mer肽段缺失（基于CRISPR/Cas9方法）的基因敲除小鼠Tcaf3（tm1/tm1）以进行活体研究。为验证这个肽段表位是否为活体中MJ23 Treg细胞发育的驱动因子，作者从MJ23tg Rag1-/-雌鼠中分离不含Foxp3+细胞的T细胞，通过注射将其转移到基因敲除小鼠和对照小鼠中。在正常对照小鼠中，供体MJ23tg T细胞分化为Foxp3+细胞，而在Tcaf3（tm1/tm1）基因敲除小鼠中则无法发生。Tcaf3（tm1/tm1）基因敲除小鼠的前列腺提取物不能在体外刺激MJ23tg T细胞，均证实Tcaf3（646–658）的特异性作用——是Treg细胞群识别的天然抗原表位，没有它就不能触发MJ23tg T细胞分化为Foxp3+的Treg细胞。在胸腺中这种组织特异性的Treg细胞克隆的发育需要单一个自体肽在胸腺中的表达。

另一个前列腺相关Treg细胞克隆的内源性肽抗原
作者尝试用同样的策略来再分析其他Aire依赖的前列腺相关Treg细胞以鉴别其肽抗原。与前列腺自体免疫损伤相关的SP33是一个丰度高的Aire依赖/前列腺相关Treg细胞株。采用相似的策略筛选，结果又是Tcaf3！肽段分析表明Tcaf3（88-107）是SP33TCR受体识别的抗原肽段。

小鼠Tcaf3是一个未知功能的102kD蛋白，主要在小鼠前列腺背外侧叶和前叶表达。此前有多个研究表明Tcaf3是前列腺自体免疫病小鼠模型中自向抗体的攻击靶标。

作者又做了一个研究。用Tcaf3（646–658）肽和完全弗氏佐剂处理健康雄性小鼠以扩增T细胞，14天后磁性筛选富集脾脏和淋巴结的Tcaf3/I-A（b）-tetramer+细胞并用双荧光标记。另外用I-A（b）限制的外源多肽2W1S作为对照。Tcaf3/I-A（b）-tetramer+细胞中64%表达Foxp3（Treg细胞重要的转录调控子和标志物），表明Tcaf3（646–658）特异T细胞多数发育为Treg细胞。作为对照的2W1S/I-Ab处理小鼠得到的2W1S/I-Ab-tetramer+细胞中只有少数表达Foxp3。

另外，实验表明，在Aire+/+小鼠中许多T细胞能被转化为Treg细胞系，而在Aire-/-小鼠中则被转为致病性的Tconv细胞。而Aire-/-缺陷小鼠用同样方法处理Tcaf3/I-A（b）-tetramer+细胞只有少数表达Foxp3的细胞，多数转化为Tconv细胞。结果显示Aire通路在引导MJ23T细胞发育为Treg细胞系过程中的作用。

前面说过要研究Treg在自体免疫失调和发展性癌症中的作用，需要先找到其识别的内源性抗原。文章作者成功找到了两种Treg细胞株对应的内源性抗原并证明其作用，为进一步研究Treg机制的秘密提供了一种可作为策略性的方法。研究癌症几十年来，大量的经费投入癌症研究，也发表了不计其数的论文，但是发展性癌症的治疗情况仍然没有显著改善，许多研究人员又将重点投向免疫机制的研究，期望以免疫系统的多变性对付癌细胞的多变性。解开Treg的机制将为这个目标带来新的希望。

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