如何利用CRISPR系统实现精确的基因knockin？[新品推荐]

CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现彻底改变了生物学领域，也迅速成为许多实验室的必备工具。这种编辑技术不仅可以用在基因敲除（knockout），也可以用于基因敲入（knockin），也就是在目标位点精确引入一段DNA序列，以便产生特定突变或插入新元件。这是通过DNA双链断裂后的同源定向修复机制实现的。

大家都知道，在真核细胞中，DNA双链断裂的修复机制主要有两种：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。HDR被认为是更准确的断裂修复机制，但它需要修复模板的存在，同时要求受损DNA和供体DNA链之间具有更高的序列同源性。

也许有人要问：我应该使用哪种修复模板，双链DNA还是单链DNA？其实，这取决于您想要实现的修饰。若希望引入较小的修饰，如单点突变或50 bp以下的突变，那么单链DNA是个很好的选择。若希望插入较大的片段，比如荧光蛋白或选择元件，那么就需要较长的DNA供体。这个供体可以是双链DNA，也可以是单链DNA。

不过，需要注意的是，双链DNA存在随机整合到基因组上的风险，因此在精确的基因编辑上的应用非常有限。相比之下，单链DNA随机整合的风险大大降低，主要是插入Cas9/sgRNA复合物所靶定的位点。此外，单链DNA供体模板对细胞的毒性要远低于双链DNA模板。

尽管单链DNA的优点多多，但它的制备难度较大，费用也颇高。以往，人们只能经济、无误地合成200 bp以下的单链DNA。一旦超过了这个长度，单链DNA的合成就变得非常昂贵，也容易出错。好在，Takara旗下的Clontech品牌近日推出了Guide-it Long ssDNA Strandase Kit，可制备长达5 kb的单链DNA寡核苷酸。

这个试剂盒提供了一种简便的方法来制备CRISPR/Cas9或者其它基因编辑技术的基因敲入实验修复模板。它选择地消化降解双链DNA PCR产物的正义链（sense strand）或者反义链（antisense strand），将其转化为单链DNA。

具体的制备过程如下（图1）。首先，通过合适的方法（克隆、融合PCR等）制备dsDNA起始模板，dsDNA模板包含与目的插入位点两侧同源的同源臂，模板中间是欲knockin的外源序列。然后，在dsDNA的不同位置上结合磷酸化的引物，制备出两种不同的dsDNA作为Strandase反应的底物。添加Strandase Mix A，开始消化正义链或反义链。接着，添加Strandase Mix B完成降解反应，从而获得ssDNA。最后，纯化ssDNA产物用于knockin实验。Clontech专家建议，同时制备ssDNA正义链和反义链并独立用于knockin实验。

 
图1. 长单链DNA（long ssDNA）供体模板制备步骤示意图。

至于ssDNA作为修复模板，效果如何，是否随机整合？研究人员也给出了详细的答案。他们打算在HEK293细胞的GAPDH的C-末端定点敲入AcGFP1基因（图2）。于是，他们设计的HDR供体模板的同源臂序列为GAPDH第8外显子的末端序列，AcGFP1与GAPDH处于同一阅读框（图A）。之后，他们通过流式细胞术比较了dsDNA和ssDNA分别作为修复模板的实验结果（图B）。

结果显示，以dsDNA作为修复模板时，即使没有Cas9 RNPs，仍然出现相当多的带有绿色荧光的细胞克隆。然而，以长ssDNA正义链或反义链作为修复模板时，只有同时加入Cas9和sgRNA，才会发生整合反应；而没有Cas9 RNPs时，则没有检测到荧光背景，说明不发生整合反应。如此看来，ssDNA随机整合的风险的确大大降低。

 
图2. 在HEK293细胞的GAPDH的C-末端定点敲入AcGFP1基因。

此外，研究人员还比较了在knockin实验中导入dsDNA和ssDNA所产生的细胞毒性。他们使用Cellartis hiPSC18细胞系。插入序列为AcGFP1，其作用是用于标记tubulin。结果显示，即使没有加入Cas9，dsDNA的导入仍然可以引起显著的细胞毒性。

 
图3. 比较knockin实验中导入dsDNA和ssDNA所产生的细胞毒性。

现在，您可以轻松愉快地制备ssDNA修复模板了吧，既不用担心dsDNA的随机整合，也无需忧虑dsDNA所带来的细胞毒性。之后，ssDNA可通过电穿孔或试剂转染的方法导入细胞，具体要取决于您研究的细胞类型。

对于电穿孔方法，同时导入细胞的还有sgRNA（利用Guide-it sgRNA体外转录试剂盒制备）以及Guide-it Recombinant Cas9。至于传统的转染实验，您可以选择同时表达Cas9和sgRNA的一体化表达载体，比如Guide-it CRISPR/Cas9 System，与ssDNA共转染。高大上的knockin实验，就是这么简单！（生物通 余亮）

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