跟着文献做实验：轻松高效地纯化外泌体

在外泌体的研究中，当务之急是高效纯化外泌体。如今的方法这么多，不知如何选择？那么，我们就来读读最新的文献，听听其他研究人员的心得体会吧。近日，澳大利亚的研究人员发表文章，展现了来源于人肾近端小管上皮细胞（PTEC）的外泌体的分子图谱。

外泌体（exosomes）这辆勤快的小货车在细胞间穿梭，运送着各种各样的分子货物，包括蛋白质、脂类、mRNA、miRNA和DNA。因此，它们在细胞间通讯中发挥着重要作用。

研究表明，外泌体由大多数细胞分泌，在体内执行着细胞免疫、组织修复、神经通讯和病原性蛋白转移等功能。它们广泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多种体液中，其蛋白质、核酸和脂肪成分各异，因而有望成为新颖的生物标志物和潜在的治疗靶点。

外泌体的研究，大多遵循着这样的路线：采用超速离心、磁珠捕获、沉淀或过滤的方法，对外泌体进行前期的分离。之后利用电镜来分析其大小和形态，利用流式细胞仪来分析细胞表面标记，再通过Western blot和ELISA等方法对蛋白进行分析，或通过qPCR和新一代测序（NGS）来分析RNA。

首先，当务之急是高效纯化外泌体。如今的方法这么多，不知如何选择？那么，我们就来读读最新的文献，听听其他研究人员的心得体会吧。近日，澳大利亚的研究人员在《Journal of Extracellular Vesicles》期刊上发表文章，展现了来源于人肾近端小管上皮细胞（PTEC）的外泌体的分子图谱。

传统方法 vs. 试剂盒

在各种肾脏疾病中，人肾近端小管上皮细胞（PTEC）调控了疾病的进程。比如，在以炎症为特征的急性损伤期，PTEC可能发挥调节作用，而在以缺氧为特征的慢性纤维化疾病状态，PTEC可能发挥致病作用。一些研究也表明，来源于PTEC的外泌体可能在疾病发展中发挥作用。不过，目前还没有研究直接鉴定正常或疾病状态下人原代PTEC中的外泌体。

为了解决这个问题，研究人员在正常条件以及代表急性或慢性疾病的炎性和缺氧条件下培养了人原代PTEC，并鉴定和纯化了外泌体。他们的结果表明，利用一种商业化的试剂盒可轻松地从人原代PTEC中纯化外泌体，并且外泌体的数量在炎性和缺氧状态下升高。这些外泌体包含了与肾脏疾病相关的miRNA和蛋白质，有望作为治疗靶点。

在这项研究中，他们比较了两种外泌体纯化方法：传统的超速离心/密度梯度（UC/DG）和商业化的试剂盒，来自QIAGEN的exoEasy Maxi Kit。他们之所以花时间来开展这种比较，是因为对之前使用的UC/DG方法不甚满意。他们表示，UC/DG方法不仅费时费力，而且容易出现技术问题，包括离心管破裂和密度梯度解离，造成外泌体样本损失。

相比之下，采用exoEasy Maxi Kit，不仅简单高效，而且重复性更好。他们的研究结果清晰表明，通过此试剂盒纯化的外泌体在质量上与UC/DG方法相当，但产量要高得多，这也许是因为样本所经历的离心步骤大大减少。

从图中可以看出，利用超速离心/密度梯度纯化（UC-DG）和QIAGEN的exoEasy Maxi Kit获得的外泌体表现出相当的纯度。这两种方法纯化所得的PTEC外泌体都表达CD9，但不表达钙联蛋白（a）。从相同量的细胞培养物中纯化外泌体，试剂盒在产量上略胜一筹（b）。通过qNano纳米颗粒分析系统的分析，这两种方法产生的外泌体在大小分布上表现相当（c）。

啥？25分钟快速纯化外泌体？

其实，QIAGEN公司与exosome Diagnostic公司合作开发出的exoEasy Maxi Kit设计的初衷就是让外泌体纯化像质粒抽提那么简单。它采用膜亲和离心柱，可从血浆、血清及细胞培养上清中纯化外泌体及其他细胞外囊泡（EV）。

当然，这个试剂盒是利用囊泡的通用生化特性来提取样本中的所有细胞外囊泡。它无法通过大小或细胞来源对EV进行区分，也不依赖于是否存在微粒表位。因此，在开始提取前需要对样品进行离心或过滤操作，以便完全去除细胞、细胞碎片、凋亡小体等组分。

它使用离心柱及专门的缓冲液来从预过滤的生物液体中纯化外泌体；可处理高达4 mL的血浆或血清。对于细胞培养上清，经实验验证可从高达32 mL的样品中成功提取外泌体。不过，上清中的囊泡浓度依赖于细胞类型及培养条件；因此QIAGEN建议上清体积不要超过16 mL。样品体积过高可能导致囊泡的回收率降低。

整个流程仅仅需要25分钟。将预先过滤过的血浆、血清或细胞培养上清与缓冲液XBP进行混合并结合在exoEasy膜亲和离心柱上。之后利用缓冲液XWP对外泌体进行洗涤，并使用缓冲液 XE（主要含无机盐的水缓冲液）进行洗脱，即可用于物理或生化分析。不过，对于生物检测等特定应用，可能需要进行额外的浓缩或缓冲液的置换。这个可通过孔径尺寸为100 kDa或更小的超滤方法来实现。

有了高纯度的外泌体在手，现在你可以分析其物理性质，也可以在电镜下细细观察。对它携带的货物感兴趣的同学，也可以提取出其中的DNA、RNA、蛋白质或脂类，来开展进一步的分析。你瞧，没有超速离心机，我们一样能玩转外泌体研究。

若你想分析外泌体中的RNA，可以像文献中那样，继续使用QIAGEN的RNeasy Kit。当然，还有一种更省时省力的方法，那就是使用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit。这个试剂盒的前半部分与exoEasy一样，之后则利用QIAGEN miRNeasy技术来分离总RNA(包含miRNA)。从血清/血浆样本到RNA(miRNA)产物，整个实验流程也只不过1小时，是不是大大超出你的预期呢。

对于分离得到的外泌体中的miRNA，QIAGEN还推出一种基于分子条形码技术的高精度特异性小RNA 快速测序文库构建方案，该方案仅需低至1ng的总RNA，无需凝胶电泳及割胶回收，7个小时就可以完成miRNA文库构建，并可有效去除文库中的接头二聚体及其他种类RNA污染，最大程度提高miRNA reads 的比对率，从而提高测序数据的利用率。同时，分子条形码(UMI) 技术还可实现超高精度的miRNA 定量分析，包含的免费数据分析与解读，真是轻轻松松就让我们揭开隐藏在外泌体中的各种秘密。

揭开外泌体的秘密，从QIAGEN的exoEasy Maxi Kit开始，索取详细资料

（生物通 余亮）