CRISPR基因编辑技术是“魔剪”还是“乱箭”？

——专访赛业生物科技副总裁欧阳应斌博士

　　

记者：欧阳博士，5月30号Nature Methods上的一篇“Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo”掀起轩然大波，短短几天，科学界已经是山雨欲来，无人不在谈论这篇文章。CRISPR为什么有这么大威力？您能否先简短介绍一下这项技术的由来？

欧阳博士：好的。30年前日本科学家石野良純在克隆一个古细菌的目的基因时偶然发现一种特别的重复序列，随后的10年研究人员一直在试图破解这种存在于很多细菌和古细菌的神秘序列，并冠以CRISPR这么个古怪的名称，直到10年前它的神秘面纱才开始被逐步揭开，原来它是一种以病毒DNA序列为精准打击对象的导弹防御系统。近几年以MIT张锋实验室为首的科学家把这种进化论产生的生物武器用在各个物种的基因改造上并把它发挥到了极致，从果蝇到斑马鱼到老鼠到猴子，我们的工具箱里突然多了一种便捷高效的基因组编辑器，一种生命科学研究前所未有的利器，也让我们的科学家插上了想象的翅膀，我们甚至可以想象利用这把利器来纠正人类的基因缺陷。投资人闻讯赶到，把大笔的钱投给了科学家创办的公司，有的公司甚至成为公众公司，很快老百姓也知道了，把更多的钱投给了他们，幻想着在不远的将来收获巨大的利益。这大概就是为什么CRISPR如此威力巨大。

记者：说起CRISPR的脱靶效应，这早已不是什么新闻了，一直以来脱靶似乎也没有那么可怕啊？

欧阳博士：你说的不错，从CRISPR出道的第一天，关于它脱靶效应的正反文章就层出不穷，仿佛是一场攻防战，一方说有问题，另一方说问题不大、我有办法。最后的舆论导向仿佛是说CRISPR的脱靶效应在可控范围，而且张博士有预测脱靶效应的免费神器，只要大家遵照张博士的指引就无大碍，大家尽可放心使用。

记者：可是与以前任何一次不同，这篇文章似乎造成了恐慌，喊了那么多次狼来了，为什么这次人们才意识到狼真的来了？

欧阳博士：你用‘恐慌’一词一点不为过，这篇文章一出，美国纳斯达克上市公司CRISPR Therapeutics的股价就应声下跌，我们公司一天之内收到N个客户电话询问我们对他们CRISPR项目的看法，并寻求预案。因为这次发现的问题彻底颠覆了之前大家对CRISPR脱靶效应的普遍看法。最突出的问题是，之前大家关注的脱靶主要是插入/缺失突变indel（insertion & deletion），而这次发现最多的脱靶却是点突变SNV（single-nucleotide variant），而且每只鼠有大约1700个点突变加上100多个indel。更匪夷所思的是，这些SNV和indel发生的位置都不在预测出来的脱靶位点上。

记者：是啊，1700个点突变，这么显而易见的事情，怎么现在才被发现？

欧阳博士：这个我也感到很不可思议。我的猜测是，大家一直没有往这个方向想，而且之前的测序深度不够，没有找到更可靠的技术发现点突变,并且研究者的关注点集中在预测出来的脱靶位点可能发生的indel。这次用的是50X的深度测序，而且关注点没有局限于脱靶位点和indel，而是拓展到全基因组的各种突变，问题就显现出来了。

记者：脱靶不是可以用MIT张锋博士的公式和他们实验室的网站预测吗？如果gRNA设计得当，不应该有这么多脱靶啊，我听说很多人在质疑gRNA的设计有问题。

欧阳博士：gRNA的设计确实直接影响脱靶，但不管这次的gRNA是如何设计的，我们的预测神器完全失灵了，预测出来的前50个脱靶位点没有一个发生脱靶。我们原来的认识是：脱靶风险是与gRNA和基因组相关位置之间的同源程度成正比的，这一次我们完全没有看到这种关系，这仿佛是要逼我们重新回到原点，重新审视脱靶的机理，原来的认识可能完全是错误的。

记者：过去短短几年，CRISPR技术席卷了整个生命科学界，甚至进入了医疗领域，这篇文章应该是泼了一盆冷水啊！

欧阳博士：确实如此，至少在医疗领域我看不到近期内的应用前景。目前CRISPR临床应用的安全性是完全不具备的，我们必须投入巨大的资源去把脱靶的真正原因找出来，并设计出有效对策。但我相信这项技术在科研上仍然不失为一个有用的工具，下一步我们必须找出问题，解决问题。

记者：这篇文章是在小鼠上用CRISPR技术做基因突变，暴露了其严重的脱靶效应，但即使如此，我们是不是仍然可以通过一些办法来区分我们设计的基因突变与脱靶突变，继续用CRISPR在小鼠上做基因功能研究？

欧阳博士：脱靶突变给小鼠模型带来的最大问题是我们不知道一个模型的表现型是我们设计的定点基因突变造成的还是我们不知道的某一个脱靶突变造成的。原则上来说，有两种传统办法可以帮助解决这个问题：一个是通过与野生鼠交配去除模型鼠中的脱靶突变，只剩下我们设计的基因突变；另一个是针对同一个模型多做几个line的鼠，看它们的表现型是不是一致的，如果一致，那这表现型就比较可能是我们设计的突变造成的。不幸的是，这篇文章的数据告诉我们这两种传统办法都无法解决CRISPR脱靶突变的问题。单说这1700个点突变和100多个indel，分布在每条染色体上平均有好几十个，通过与野生鼠交配去除这些突变是很困难的，因为每一代交配发生在每一条染色体上的同源重组平均也就不到一次，即使把这个突变数降低一个数量级，通过几代的交配来去除，仍然是非常困难的。更要命的是，这篇文章发现分别在两个line的老鼠上的这大约1700个点突变和100多个indel大部分都是相同的，所以通过多拿到几个line的小鼠并得到相同的表现型来说明该表现型来自我们设计的基因突变而非脱靶突变是难以成立的，因为不同line的脱靶突变很可能也是一样的。当然深度的二代测序可以告诉我们脱靶的真相，但这太贵太耗时了，也不能去除脱靶突变。

记者：那用CRISPR做小鼠的基因突变还可行吗？

欧阳博士：与传统的ES细胞基因打靶技术制备基因工程小鼠相比，CRISPR技术的最大优点是快捷和低成本。但如果脱靶的问题不能解决的话，用该方法来制备基因工程小鼠显然远远没有ES基因打靶可靠，尤其是像条件性基因敲除（cKO）这样复杂昂贵的项目，实在不建议用CRISPR，因为不用花多得太多的代价和时间，完全可以用ES打靶这个久经考验的金标准。我们两年前推出的TurboKnockout技术平台，在传统ES基因打靶上引入了两项重大技术革新，进一步压缩了ES打靶的周期和成本，是加大了这个金标准的优势。我们的人工智能设计网站www.alphaknockout.com更是简化了方案的设计，我们的技术完全可以弥补CRISPR的不足。

记者：非常感谢您再次接受我们的采访。

欧阳博士：不客气，我也很荣幸！

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欧阳应斌 博士 高级科学家
现任赛业生物科技技术副总裁、高级科学家。
研究方向：主要负责转基因鼠及基因敲除小鼠平台的管理及优化

欧阳应斌（Marvin Ouyang）于1997年开始就职于美国Oklahoma医学研究基金会，担任高级科学家，成功发现、纯化并克隆了两种硫蛋白转移酶，成功建成基因敲除小鼠模型。2002年担任美国Thios生物制药公司生物部高级科学家，推动了硫酸转移酶小分子抑制剂及重组抗体制药的研发。从2004年开始担任美国Taconic生物科技公司分子生物学部主管，率领十余位科学家成功开发建成四百余种转基因小鼠及大鼠实验动物及疾病模型。在PNAS、Mol Cell Biol.、J. Biol. Chem.等高水平杂志发表论文10余篇。欧阳博士于2012年加入赛业生物科技（ Cyagen Biosciences）公司，主要负责转基因鼠及基因敲除小鼠平台的管理及优化。

赛业生物科技简介
赛业生物科技集团是全球领先的多元化跨国生物科技实体，2006年成立于美国，中国区总部设立在广州，并在苏州设有子公司，北京、上海、武汉、重庆等地均有办事处。目前员工人数达400余名，总规模超22000平方米，业务经营范围涵盖模式动物、细胞生物学、分子生物学、生物信息学等生命科学领域的多个分支学科。

作为全球领先的转基因/基因敲除模式动物商业技术平台，赛业模式生物研究中心达10000平米，其中包括5000平米的SPF级动物实验室，配备有IVC和EVC饲养设备超过500套，可养殖SPF级大小鼠近30000笼，动物种群规模超过15万只。每年可构建基因敲除鼠、转基因鼠模型10000例以上，学术引用累计超过1200篇，是目前国际上最主要、最被认可的基因工程模式动物商业服务平台之一。自主开发的全球首款功能强大的在线载体设计工具VectorBuilder，每年可定制载体超30万个，彻底颠覆生物技术领域传统格局，打造载体构建金标准和新模式。
 2009年，赛业通过ISO9001:2008认证并于2012年顺利通过复审，确保向广大专家学者提供的所有产品和技术服务符合国际标准。AAALAC认证的顺利通过，使赛业成为华南地区极少数个获得国际实验动物评估和认可委员会国际认证的单位之一。这不仅是实验动物质量和生物安全水准的象征，更是国际前沿医学研究的质量标志。

赛业公司目前在美国加州Santa Clara 建立起活体实验鼠检测、隔离中心，成为国内唯一一家具有活体实验鼠类出口能力的生物企业；通过国家出入境检验检疫部门的考核，成为华南地区第一家生物材料出入境绿色通道试点单位，加速了实验动物出入境审批流程，并进一步提升了赛业模式动物中心国际服务的能力。

目前公司的产品和技术服务已为全球数百个顶尖生命科学实验室和跨国制药公司提供了帮助，秉承着“为生物科技创造无限可能”的企业愿景服务于全世界的科研学者！