首都医科大学Circulation：转录因子ATF3为心力衰竭提供治疗新思路

来自首都医科大学的杜杰教授团队在《Circulation》 (IF=19.309)发文，揭示了内源保护性转录因子ATF3抵抗心力衰竭发生的机制，为研究转录因子在心血管疾病的作用提供思路。

　　

心力衰竭是多种心血管疾病的严重和终末阶段，它是指心脏的收缩功能和（或）舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群。

心力衰竭在我国有着较高发病率和患病率，并呈不断增长的趋势。导致心力衰竭的常见原因是心室重塑，然而，调节心室重塑的分子机制仍然知之甚少。心力衰竭（HF）可以被看作是一种抗增生性基因调控障碍，基因表达的特异性调节主要通过转录因子实现，转录因子有希望成为新的治疗靶标。近日，来自首都医科大学的杜杰教授团队在《Circulation》 (IF=19.309)发文“Cardiac Fibroblast-Specific Activating Transcription Factor 3 Protects Against Heart Failure by Suppressing MAP2K3-p38 Signaling”，揭示了内源保护性转录因子ATF3抵抗心力衰竭发生的机制，为研究转录因子在心血管疾病的作用提供思路。

该研究以两种高血压性心衰动物模型的心脏转录组数据为基础，并采用双重原位杂交和活细胞分选等技术，发现了调控心肌肥厚和心衰的关键转录因子ATF3，并确定了心脏成纤维细胞是ATF3表达的细胞来源。随后，使用通过原核显微注射方法，注射线性化的pRP.ExBi-EF1A-loxp-stop-loxp-mAtf3质粒，获得条件性Atf3基因过表达的转基因小鼠（过表达的ATF3转基因小鼠由赛业生物科技提供），进一步证实了ATF3可保护心脏免受高血压诱导的心力衰竭，揭示了其保护机制。为验证此发现的临床应用，研究团队利用肥厚性心肌病患者心脏组织证实了此发现，并发现心脏成纤维细胞特异性递送ATF3可有效阻止了心肌肥厚和纤维化发生。

该项研究发现了转录因子ATF3的活化是内源防止心力衰竭发展的关键事件，为心力衰竭提供了新的治疗思路。

研究方法：
1、ATF3在高血压动物和心力衰竭患者的心脏组织中是如何持续高表达的？     

为了识别调节高血压心脏重塑的转录因子TF，对来自两种不同的高血压心脏样本进行转录组表达检测。重塑模型：Ang II输注（7或28天，心室重塑显著和不显著的两个代表性时间点， RNA-seq，三分组，每组2个生物学重复）和TAC处理（28天，AffymetrixClariom D array，两分组，每组2-3个生物学重复）。结果发现：与对照相比，在Ang II输注后7或28天分别有1019和647个差异表达基因（筛选标准: p <0.05，FC> 2）。与相对对照相比，AngⅡ输注28天后和TAC共有537个差异基因（筛选标准：p <0.05;倍数变化> 1.5）。

为了识别编码TF的DEGs，从TRANSFAC数据库确定的1100个候选TF（TF转录因子生物信息学预测）和以上两组差异基因进行比较，分别筛选出41个TF（Ang-II输注组后7天）； 29个TF（Ang-II输注组后28天）和42个TF（TAC组后28天）DEGs是TF编码基因。进一步分析发现，Ang II输注后7或28天两个时间点共有22个差异表达的TF基因，在Ang II输注组和TAC组之间共有7个差异表达的TF基因。在这7个TF中，ATF3基因持续显著上调。测序和芯片数据结果一致，在Ang II输注和压力心脏中ATF3mRNA和蛋白水平显著上调。接下来，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI相互网络），预测出ATF3与48种重要蛋白质相互作用，包括参与免疫应答的复合物（Rela，Jun，Junb，Jund，Fos），纤维化（smad2 / 3）和凋亡（p53，ATF4，ATF2）。

同时在临床肥厚性心肌病（HCM）患者上进一步验证，发现ATF3在人心脏组织中的转录水平和蛋白水平显著上调。总而言之，这些结果强烈表明ATF3可能发挥监管作用高血压心室重塑。

2、如何确认心脏成纤维细胞是刺激表达ATF3的主要细胞类型？

不同心脏细胞类型以不同的分子机制来调控整体心脏功能。研究进一步确定了ATF3在高血压心脏表达中的细胞性来源。原位杂交（ISH）显示：在盐水处理的动物中ATF3染色非常弱，而Ang II输注后增强。重要的是，ATF3染色富集在心脏间质，不在心肌细胞或血管细胞内。双重组织切片染色结果显示ATF3信号主要在成纤维细胞（DDR2 +，Col1a1 +）中富集强，在巨噬细胞（CD68 +）中富集较少。同时，通过荧光激活细胞分选计数将CD45-PDGFR-Į-CD31-心肌细胞，CD45-PDGFR-Į+心脏成纤维细胞，CD45-CD31 +内皮细胞和CD45 + F4 / 80 +巨噬细胞分选出来，并用qRT-PCR检测ATF3在不同心脏细胞中表达水平。

3、心脏成纤维细胞中ATF3上调是高血压心室重塑和心力衰竭过程中自我保护的代偿性机制吗？

前期结果已经证明ATF3在心衰心脏的成纤维细胞中显着上调，接下来需要进一步确定ATF3上调是否有助于保护机体免受心室重塑。本研究采用了四种独立的方法来证明。

第一种——基因敲除方法。ATF3敲除（ATF3KO）小鼠和野生型（WT）小鼠进行Ang II输注。Ang II输注后WT和ATF3KO小鼠血压都有升高，差异不大，而在胶原沉积上ATF3KO小鼠中明显高于WT小鼠。且a-SMA蛋白、胶原I和TGF-β的转录水平显著上调。Ang II输注后，与WT相比，ATF3KO小鼠体重增加更显著，心肌细胞肥大更严重， Myh7和ANP（肥大相关基因）的mRNA水平也显著升高。这些数据表明ATF3上调是心衰过程中的一种自我保护机制。

第二种——病毒介导的拯救方法。为避免心肌细胞中ATF3过表达，建立了一种miRNA辅助/慢病毒（LV）介导的系统。mir-1a和mir-133a是心肌细胞中最丰富的miRNA，研究者设计了携带有Ubi启动子驱动的ATF3表达盒的载体盒，该启动子包含2个串联拷贝的在3'末端的mir-1a-3p和mir-133a-3p链的22-bp互补靶序列（LV-ATF3-mir1/133TS）。LV-control-mir1/133TS作为载体对照。我们首先将LV-ATF3-mir1/133TS和LV-control-mir1/133TS（50PFU /细胞）载体转染原代心肌细胞和成纤维细胞（分离自ATF3KO小鼠）。在LV-ATF3-mir1/133TS转染的心脏成纤维细胞中ATF3的表达明显上调，而在心肌细胞中仅略有上调。LV载体通过尾静脉注射到ATF3KO小鼠（每只小鼠3×108PFU剂量）。为提高这个方法特异性，从ATF3KO小鼠中分离GFP+心脏成纤维细胞和GFP+心肌细胞，发现ATF3蛋白在心脏成纤维细胞中显着增加，但在心肌细胞中仅略有增加。ATF3KO小鼠给予LV-对照，LV-Con-mir1/133TS或LV-ATF3-mir1/133TS，随后AngII输注7天。7天后，收集心脏组织进行组织病理学检查并分离出心脏成纤维细胞，发现ATF3在LV-ATF3-mir1/133TS转导的ATF3KO小鼠心脏组织中显著上调。总而言之，这些数据显示了ATF3KO小鼠表型可被miRNA辅助/慢病毒介导的成纤维细胞ATF3过表达成功实现心脏拯救。

第三种——获得性功能方法。研究者构建了条件性心脏成纤维细胞特异性ATF3-转基因小鼠模型（ATF3fl / flTG）。 ATF3fl / flTG）小鼠与诱导型成纤维细胞特异性Cre小鼠（col1a2-Cre/ERT）杂交。腹腔注射他莫昔芬激活基因表达。为了评估转基因渗漏，我们检测了Col1a2和ATF3在心脏，肝脏，肺，肾脏，脾脏和血管中的表达。高表达Col1a2仅在心脏和血管中观察到，肾脏中低表达，而在其他器官中无显著差异。ATF3在ATF3fl / flTGCre- 或WT小鼠的所有器官中都无显著性差异。在ATF3fl/ flTGCre+小鼠中，ATF3表达水平仅在心脏和血管中显着升高，肾脏中轻微升高，在其他器官中没显著性差异。与ATF3fl/flTGCre-小鼠相比，源自ATF3fl/flTG Cre +小鼠心脏成纤维细胞中ATF3 的转录水平显着上调（而心肌细胞中没有显著差异）。使用谱系追踪技术，确定了Col1a2与Col1a1（心脏成纤维细胞），CD31（内皮细胞），SM22（平滑肌细胞）和Col2a1（瓣膜细胞）共定位。Col1a2+细胞与Col1a1阳性细胞存在共定位，与CD31，SM22或Col1a1阳性细胞则不存在这类现象。双重免疫荧光染色显示在ATF3fl/flTGCre +小鼠中ATF3主要表达于Col1a1 +或Col1a2 +心脏成纤维细胞。总之，这些数据表明Col1a2 +细胞是心脏成纤维细胞的特异性细胞，ATF3在ATF3fl/flTGCre +小鼠心脏成纤维细胞中特异性表达。

为了研究ATF3过表达对心脏重塑的影响，分别注射他莫昔芬Cre +、ATF3fl/flTGCre-和ATF3fl/flTGCre+小鼠，然后再分别用盐水或Ang II输注12周。结果发现：与Cre +、ATF3fl/flTGCre-小鼠相比，ATF3fl/flTGCre +小鼠的心脏成纤维细胞中ATF3蛋白质表达显着上调。Ang II诱发的整体和微观病理变化在ATF3fl/flTGCre+小鼠中显着减弱；具体来说，心脏体积变小；左心室扩张减缓；心脏纤维化减轻。此外，心肌细胞横截面积显著变小。与Cre +、ATF3fl/flTGCre-小鼠相比，ATF3fl/flTGCre +小鼠的心脏成纤维细胞中ANP和Myh7的mRNA水平显著降低。最后，Ang II输注的ATF3fl / flTGCre +小鼠中心功能明显改善，心室扩张明显降低。

第四种——骨髓移植。与盐水对照相比，Ang II输注将适度增加巨噬细胞ATF3表达，下面进一步确定Ang II输注后巨噬细胞ATF3表达是否有助于心脏保护。我们进行了BM移植（BMWT ——ATF3KO或者BMATF3KO ——WT小鼠），然后Ang II输注28d。结果发现：与BMWT ——WT小鼠相比，BMWT ——ATF3KO小鼠中ATF3表达水平显著下调，而在BMATF3KO ——WT小鼠中ATF3表达则无显著性差异。更重要的是，不论BM什么来源（BMWT还是BMATF3KO），ATF3KO 受体小鼠都表现出更严重的心室重塑（心脏纤维化和肥大增强）。相比之下，不论BM什么来源（WT或ATF3KO），WT受体小鼠都没有表现出严重的心室重塑。

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4、ATF3如何抑制靶基因Map2K3介导的心脏保护作用（ATF3的分子机制研究）？

为了探索ATF3如何调节心室重塑，采用两种策略进行鉴别Map2K3调控基因(负责ATF3-Map2K3下游信号传导)。

首先，从Ang II输注的WT或ATF3KO小鼠中分离成纤维细胞，并进行转录组检测（RNA-seq）寻找下游靶标，结果发现701个上调基因，468下调基因（筛选标准：FDR <0.05；倍数变化> 1.2）。为验证RNA-Seq数据的准确性，随机选择10个差异基因进行qRT-PCR验证，发现RNA-Seq和qRT-PCR结果之间可达到90％的吻合度。ATF3KO心脏成纤维细胞差异表达基因多与纤维化，肥大和炎症相关。通路富集分析显示，上调信号通路与高血压心脏重塑密切相关，特别是ECM沉积（局灶粘连和ECM-受体相互作用）；肥大（胰岛素，MAPK和mTOR信号）和炎症（细胞因子-细胞因子受体相互作用和白细胞跨膜迁移）。最后，根据47个显著性通路及其相互作用构建Path-Net网络分析，来确定ATF3介导的保护作用中最核心的信号通路。分析结果发现：在ATF3KO细胞中MAPK信号通路基因表现出最大富集度。

其次，从ATF3KO小鼠中分离心脏成纤维细胞，并分别转染ATF3过表达（Ad-ATF3）或空（Ad-con）腺病毒两种载体，然后进行Ang II体外刺激。在转染细胞中证实ATF3表达上调后，进行ATF3 CHIP-seq实验。我们选择性鉴定出在ATF3过表达的心脏成纤维细胞中高度富集的727个ATF3靶基因。为了进一步缩小ATF3介导基因范围，我们进行了两层生物信息学分析：1）WT和ATF3敲除成纤维细胞转录组的差异基因中与ATF3靶标基因相的；2）用分别转染有Ad-con和Ad-ATF3的ATF3敲除成纤维细胞进行ATF3 ChIP测序，两者的差异基因用于ATF3结合基因进一步筛选。最后筛选出31个基因——被鉴定为直接与ATF3结合的靶标基因。结合这两个策略的结果，我们集中在MAPK通路基因。ChIP-seq分析表明Map2K3上存在有显著性的ATF3结合启动子区域。独立CHIP测序也证实Map2K3的富集水平显著高于正常IgG。有趣的是，Map2K3转录水平在ATF3KO心脏成纤维细胞中表达显著上调，而在Ad-ATF3转染的心脏成纤维细胞中表达显著下调，这表明该转录因子抑制，而不是刺激Map2K3表达。与体外研究结果一致，Map2K3转录和蛋白水平在Ang II注射的ATF3KO小鼠心脏成纤维细胞中显着上调；而在ATF3fl/flTGCre +小鼠心脏成纤维细胞中的表达降低。

为了在ATF3KO动物中进一步确定Map2K3上调与高血压心脏重塑恶化之间的因果关系，研究者进行了一些功能验证实验。分离出心脏成纤维细胞，并用Ang II体外处理。与对照相比，Ang II诱导的a-SMA和胶原蛋白I在心脏成纤维细胞中的表达水平更胜于ATF3KO小鼠（图7A）。在ATF3KO心脏成纤维细胞中，抑制Map2K3（表达Map2K3 shRNA的慢病毒——LV-Map2K3-shRNA）可以显著降低Ang II诱导的D-SMA和胶原蛋白I的表达。心脏成纤维细胞通过旁分泌调节心肌细胞。接下来，将心肌细胞与分离自ATF3KO小鼠的心脏成纤维细胞共同培养，发现Map2K3可抑制Ang II诱导发生的心肌细胞肥大作用。用LV-Map2K3-shRNA基因抑制Map2K3可显着抑制Ang II诱导的ANP表达和降低心肌细胞大小。

以上结果都表明ATF3抑制Map2K3基因表达，接下来进一步研究ATF3抑制Map2K3转录的潜在分子机制。通过PPI网络分析证明ATF3与组蛋白脱乙酰酶（HDAC）的相互作用。Co-IP检测结果也表明HDAC1确实存在于ATF3-免疫沉淀复合物中。最重要的是，Map2K3结合组蛋白乙酰化蛋白（H4ac）的启动子区域在Ang II诱导心脏成纤维细胞中显着富集增加，而在ATF3过表达时显着减少。

5、p38 MAPK激活介导ATF3缺失诱导的纤维化和低血压

Map2K3通过激活p38 MAPK实现不同的生物学功能。结果表明p38及其下游靶点MAPK激活的蛋白激酶2的磷酸化水平在分离自Ang II输注的ATF3KO小鼠心脏成纤维细胞中显著增加。而与TGCre小鼠相比，ATF3fl/flTGCre+小鼠的p38磷酸化水平在心脏成纤维细胞中显著降低。这些数据表明ATF3可能通过抑制Map2K3表达，进一步抑制p38，从而抑制高血压重塑。我们进行了补充实验，以验证以上结果。首先，将心肌细胞与从ATF3KO动物分离的心脏成纤维细胞共培养，发现p38抑制显著降低Ang II诱导的ANP 转录水平和心肌细胞大小，这与Map2K3基因抑制的结果相似。鉴于TGF-β在心脏重塑发挥作用的广泛认知，以及辅以高通量二代测序实验结果发现的p38抑制后3个关键下调信号通路（RNA-seq+通路富集分析），表明ATF3KO小鼠中p38抑制作用依赖于Ang II激活的TGF-β信号通路。qRT-PCR结果表明：ATF3缺陷的心脏成纤维细胞中TGF-β通路相关基因（包括Tgfb2，BMP4，Thbs2，Thbs3，Col1a1，Col3a1，Igf1，Itgb5和Igfbp5）的表达水平显着上调；而在p38抑制后则被抑制。目前已知TGF-β介导纤维化和心肌细胞肥大相关的多种信号分子（包括IL-6，内皮素-1，FGF2和磷酸化Smad3）在Ang II输注处理ATF3缺陷的心脏成纤维细胞中都显著增加。这些作用在p38抑制后消除。

为了进一步确定以上结果，我们进行了跨物种验证。对来自5个HCM患者的心脏组织（HCM患病组）和4个正常组织（正常组）进行转录组检测；同时对p38抑制剂预处理的Ang II诱导心脏成纤维细胞（p38+Ang II组）和未用p38抑制剂预处理的Ang II诱导心脏成纤维细胞（con+Ang II组）进行转录组检测。HCM患病组和正常组比较结果发现970个上调基因和829个下调基因（筛选标准：p <0.05，倍数变化> 1.5）。通路富集分析发现了HCM中七个最显着的上调通路，包括ECM受体相互作用，局灶粘连，肌动蛋白细胞骨架调节，肥厚性心肌病，扩张性心肌病，TGF-β信号通路，致心律失常性右心室心肌病。在p38抑制剂治疗后，心肌成纤维细胞中HCM特异性标记显著下调，且63个差异基因表现出相同的调控方向（43个基因上调，20个基因下调）；121个基因表现出相反的调控方向（97个上调基因，24个下调基因）。而且，通路富集分析显示p38抑制后，97个交集下调基因主要富集在7个标志性HCM通路上。

研究结论：

总结来说，高血压刺激成纤维细胞中ATF3高表达，它可以通过抑制Map2K3，从而进一步抑制p38-TGF-β传导通路表达来保护心脏。这些结果表明心脏的正调节成纤维细胞ATF3可能代表抗高血压心脏重塑的新型治疗方法。

 

杜杰教授

1985年毕业于北京大学生物系，1989年赴美国留学。先后作为博士后、助理教授、副教授在美国Emory University School of Medicine, Baylor College of Medicine从事心血管，高血压发生及其危害，肿瘤方面的研究。曾主持及参与多项美国NIH R01心血管研究课题。于2008年回国任教育部长江特聘教授，同年获得国家自然科学基金杰出青年称号。2010年任教育部心血管重塑相关疾病重点实验室主任，2011年任教育部长江创新主动脉瘤研究团队主任。目前任北京安贞医院院长助理，北京市心肺血管疾病研究所副所长，教授，主持包括国家“973”课题，北京市心血管病理生理平台课题，国家自然科学基金重大、重点等基金。累计发表SCI论文120余篇。杜杰教授目前担任中华医学会心血管分会基础组副组长、中华生理学会循环生理专业委员会副主任委员、中国动脉粥样硬化委员会常委等。担任Cardiovascular Toxicology副主编，Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology副主编，Cardiovascular Drugs and Therapy编委，Frontiers in Vascular Physiology编委，《中华分子心脏病学》副主编，《中国动脉硬化杂志》编委，《临床心血管病杂志》编委，《心肺血管疾病杂志》编委，《中华高血压杂志》编委，《转化医学杂志》编委等。