FFPE核酸抽提传统方法 vs 自动聚焦声波技术

福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)方法保存固体组织可以准确地保存组织形态，常为临床病理学家所采用。估计世界范围内有> 10亿的 FFPE样本，是目前疾病分子层面及临床研究的重要样本来源，因而十分珍贵。不过由于FFPE样品保存过程中核酸已经部分降解了，且DNA往往与组蛋白紧密交联，因而很难获得足量和高质量的DNA。

传统的FFPE核酸抽提方法主要是通过二甲苯或矿物油进行被动扩散脱蜡，多种有机溶剂/水孵育进行组织被动复水，组织匀浆，蛋白酶处理进行组织消化解交联，*后用苯酚氯仿或硅胶模过柱或磁珠法进行DNA的抽提纯化。目前市面上较多FFPE提取试剂盒都属于这一类传统方法，不过都或多或少进行了改进和优化，如Qiagen 提供了新型脱蜡液，加入脱蜡溶液后无需沉淀FFPE样品和去除含有石蜡的上清，减少了样品损失，并缩短了蛋白酶K孵育的时间。

除了这一类传统常规FFPE核酸抽提方法，Covaris 基于**自动聚焦声波技术（Adaptive Focused Acoustics， AFA）的方法也值得关注。Covaris truXTRAC™ FFPE核酸抽提主要通过精准控制的聚焦声波能量对FFPE样本进行脱蜡再水化和组织消化、解交联、核酸释放和纯化。通过超声乳化、脱蜡：提高样本水化效果和生物大分子解离，告别二甲苯等有机溶剂由于脱蜡效率和试剂残留可能造成的对下游实验的干扰，从样本到可用于NGS等下游应用的核酸，整个过程仅需不到3小时，同时多数传统的脱蜡方法仅可处理5-10 μm厚的组织切片，但Covaris方法可处理5-25μm厚的FFPE组织切片。

那么这两大类型方法，究竟哪一类方法更适合分子诊断层面的需求呢？美国Roswell Park 癌症研究所Personalized Medicine中心的研究人员对二者抽提的核酸样本在各大主流测序平台上进行了验证比较。
研究人员在研究肺癌FFPE样本时对于Qiagen的硅胶模过柱法和Covaris的AFA方法进行了一系列包括DNA得率、质量以及两者抽提的核酸进行后续NGS建库选取如下肺癌常见检测基因（见Table1）检测SNV、插入缺失、拷贝数变异等，进行了一系列的比较。

研究者选取了8种类型癌组织FFPE样本，包括肺癌，用14 gauge大小的解剖针取样，同一样本上的取下的两个core，分别用Covaris truXtract FFPE DNA isolation和QIAGEN DNeasy tissue kit方法提取核酸。用Qubit and NanoDrop检测得到DNA量和纯度，2100 BioAnalyzer预估片段大小。另一边选取6个肺癌组织，相同方法分别取样后同样分别用两种方法提取DNA。用焦磷酸测序 (PyroMark)、Ion AmpliSeq PGM和Illumina (MiSeq)NGS二代测序平台进行突变分析，用NanoString nCounter system分析拷贝数变异。Covaris组DNA样品额外进行了1:2和1:4的稀释处理。

结果：Covaris提取的DNA样本得率和片段长度大多数优于Qiagen提取的。Covaris truXtrac DNA 样本在进一步的分子诊断测试中也表现的更优。尤其是在MiSeq NGS平台，提高了簇密度和覆盖度；Nanostring nCounter 要求的片段长度比PGM还要长，Covaris truXtrac DNA样本组提高了在nCounter上的count。（见Table2和Figure2）。

Covaris提取的DNA样本通过了在PyroMark测序仪上的验证，稀释25%~50%的样本也通过了OmniSeq Target NGS测序验证（见Table3）。

研究者*后得出结论与Qiagen提取相比Covaris truXtract isolation kit为肺癌FFPE样本提供了一个良好提取高质量DNA的解决方案，包括DNA得率和片段大小，预示着即使更小的组织切片也可以收集和提取来进行进一步的分子诊断。此外，Covaris提取的DNA在NGS测序平台上可以减少25-50%而不影响实验。

难怪主流测序平台公司如三代单分子测序Pacbio、Illumina旗下Lucigen（原Epicentre）等在处理FFPE样本时，均推荐Covaris truXtract。此外，DNA片段化也可同时在truXTRAC流程中完成，简化了测序文库制备的流程。

Covaris truXtrct FFPE DNA/RNA试剂盒在Covaris 各型号平台上均可使用，试剂成本目录价约￥170/样。如果您已经有Covaris平台，除了核酸片段化，还可以拓展它例如FFPE样本核酸提取、Chip染色质剪切等应用。如果您暂未有Covaris平台，又面临FFPE核酸样本抽提质量不高的问题，请联系我们，我们可以为您介绍您身边的Covaris平台。

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参考文献:Jeffrey Conroy, Hanchun T. DeFedericis ,et al.DNA Extraction of Lung Cancer Samples for Advanced Diagnostic Testing[J]. OminiSeq Precision Medicine Technology,2016,Sept 9th.