如何利用CRISPR/Cpf1系统实现多重基因编辑[创新技巧]

【字体：大中小】 时间：2017年05月15日 来源：生物通

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　　CRISPR基因组编辑领域可谓日新月异，每月都有新成果涌现。不久前，CRISPR技术先驱张锋（Feng Zhang）领导的团队发表文章，介绍了如何使用Cpf1来进行多重的基因组编辑。与常用的Cas9相比，Cpf1将多重编辑大大简化，这是如何实现的呢？

生物通报道 CRISPR基因组编辑领域可谓日新月异，每月都有新成果涌现。不久前，CRISPR技术先驱张锋（Feng Zhang）领导的团队发表文章，介绍了如何使用Cpf1来进行多重的基因组编辑。与常用的Cas9相比，Cpf1将多重编辑大大简化，这是如何实现的呢？

Cpf1出现之前

在这种新的Cpf1方法出现之前，其他的CRISPR多重基因编辑完全依赖于Cas9。总的来说，这些方法主要有两个缺点：

1. 大部分方法需要转染不止一个载体，它们表达gRNA和Cas9。由于拷贝数的差异，共转染可能导致表达水平有变化。此外，还有一个普遍存在的缺点，只能瞬时表达，并且需要可转染的细胞系。

2. Cas9系统需要较大的表达载体，这使其难以转染或包装到病毒载体中。Cas9多重载体往往更大，因为它们需要调控序列来实现多个gRNA的表达，比如Csy4切割序列、tRNA以及多个单独的启动子。

表1：Cas9多重编辑方法

多重方法	导入方法	优点	缺点	参考文献
Golden Gate Assembly	转染	一个载体表达Cas9和多达7个gRNA	每个gRNA需要自己的启动子	Sakuma et al
Multiplexed Lentiviral Expression Cassettes	慢病毒转导	一个载体表达Cas9、eGFP和多达4个gRNA	每个gRNA需要自己的启动子	Kabadi et al
Csy4-Cleavable Cassettes	转染	通过一个多顺反子的转录本表达gRNA	需要共转染Cas9	Nissim et al Tsai et al
PTG Cassettes	转染	通过一个多顺反子的转录本表达gRNA	需要共转染Cas9	Xie et al

Cpf1出现之后

与Cas9不同，Cpf1能够自身加工前体crRNA，随后利用加工的crRNA特异性地靶向和切割DNA。Cpf1这种加工crRNA的能力能够简化多重基因编辑。张锋实验室的研究人员证明，Cpf1在体外和哺乳动物细胞中最多能够切割4个crRNA的阵列（Array）。这样，单个启动子就能驱动crRNA阵列的表达，而不需要表达其他的核酸酶，如Csy4。

小贴士：在克隆过程中，研究人员使用了4个特别的寡核苷酸，它们包含直接重复和crRNA。与拼图类似，这些寡核苷酸带有粘性末端，只能朝一个方向退火。具体示意图如下。记得订购5’磷酸化的寡核苷酸，或者用T4多聚核苷酸激酶处理哦。

图1：crRNA寡核苷酸只能朝一个方向退火。

如何导入

既然Cpf1具有这种自我加工的能力，那也就没必要用多个启动子来驱动crRNA表达，或者添加一些方便加工的序列，如Csy4切割位点。因此，crRNA表达载体更加简化，更加轻巧，适用于多个表达平台：转染、慢病毒转导以及腺相关病毒（AAV）转导。

在张锋实验室的大多数实验中，他们使用了共表达Cpf1和crRNA阵列的单个载体。当表达crRNA阵列、Cpf1和GFP标签的单个质粒转染时，6.4%的HEK293T细胞实现了4个目标的编辑。不过，若转染多个质粒，其中每个质粒表达一个crRNA，再加上一个Cpf1表达载体，4重编辑的细胞仅为2.4 %。图2比较了单个质粒和混合质粒的编辑效率。对于多重编辑，单个质粒显然更有效。