华人先锋：源自CRISPR的低成本，高灵敏性诊断技术

　　

生物通报道：一组科学家们改进一种CRISPR蛋白，研发出了靶向RNA，而不是DNA的快速，便宜，高灵敏度的诊断工具，可以用于检测诸如寨卡病毒感染和登革热感染等的疾病，这一进展也有助于便捷检测和诊断许多其它的病原体。这一研究成果公布在Science杂志上，由张锋研究组联合MIT的Jim Collins研究组完成。

目前已经不少方法可以检测基因序列，但这些方法在灵敏度、特异性、简易性、成本和检测速度等方面都存在缺陷，为了寻找更好的方法，研究人员转向了以RNA为靶标的CRISPR-Cas系统，同时他们也加入了一个报告RNA，该报告RNA在被切割时会释放出荧光信号。另外为了增加灵敏度，研究人员还采用了一种重组酶聚合酶扩增的技术来进一步地增强灵敏度。

由此研究人员得到了一个新的系统：SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），SHERLOCK可检测血清、尿液和唾液中低浓度的寨卡病毒，而且可以用于检测病毒载量，区分不同的菌株，甚至能分辨独有不同耐药突变的肺炎菌株。研究人员还表示SHERLOCK可被用来检测不同的癌症突变，具体见下：

•几小时内检测患者血液或尿样中是否存在寨卡病毒；

•区分非洲和美国寨卡病毒株的基因序列；

•区分特定类型的细菌，如大肠杆菌；

•检测抗生素抗性基因；

•识别模拟无细胞DNA片段中的癌变突变；

•从唾液样品中快速分析人类遗传信息，如心脏病患病风险。

2016年6月，张锋研究组首次描述了RNA靶向CRISPR酶，现在称为Cas13a（以前称为C2c2），可以用于切割细菌细胞中的特殊RNA序列。Cas13a与DNA靶向CRISPR酶（如Cas9和Cpf1）不同，这种酶在切割其靶向RNA后可保持活性，而且可能表现出混杂行为（promiscuous behavior），继续切割其它非靶向RNA，这被张锋实验室称为“附属切割”（collateral cleavage，生物通译）。这一研究组在其发表论文和专利申请中，描述了该系统广泛的生物技术应用，包括利用RNA切割和附属活性进行基础研究，诊断和治疗。相关论文介绍的Cas13a特点包括：

•C2c2是一种双组件系统，只需要一条向导RNA来发挥功能

•C2c2遗传上可编码——这意味着可将必要元件合成为DNA传递到组织和细胞中。

•添加一些模块到特定RNA序列中改变它们的功能（翻译成蛋白质的方式），这将使得它们成为用于大规模筛查及构建合成调控网络的有价值的工具。

•利用C2c2荧光标记RNAs作为一种方法来研究RNA的运输和亚细胞定位。靶向RNA的新型CRISPR系统

在2016年9月的Nature杂志（Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection）上，Jennifer Doudna，Alexandra East-Seletsky及其同事分析了Cas13a的切割特性，指出C2C2并不像以前认为的只有一种、而是有两种不同的RNA切割活性，它们一起可以被用于强大的RNA检测与降解。

Doudna说“这项研究扩展了我们对C2c2指导RNA加工的理解，并提供了这种新型RNase的第一种应用。C2c2实质上是一位自我武装的哨兵，在检测到其靶标后可攻击所有RNA。这种活性可以被用作一个自动放大检测器，作为一种低成本的诊断法可能是有用的。”

但是这种方法依然缺乏许多研究和临床应用所需的灵敏度。最新研究采用了Collin研究组之前研发的纸质寨卡病毒检测技术。将这两种技术结合起来的新系统能够以极低浓度检测单RNA和单DNA分子。 增加放大步骤有助于将检测的灵敏度提高到百万分之一，并且能引入冷冻干燥等其它应用程序，从而真正构建出一种强大的工具。目前利用这一技术，可以在短短一个小时内对样品进行检测，而且其设备也是便携式的，成本也很低。

文章的作者之一Deb Hung表示，“这个系统吸引了许多人的兴趣。目前还有很多工作要做，但如果SHERLOCK可以发挥其潜力，那么将会从根本上改变常见和新出现传染病的诊断现状。”

另外一位作者Pardis Sabeti指出，“SHERLOCK最重要的特征之一就是能在没有大量复杂和耗时上游实验的情况下进行检测。采取原始样品并立即开始处理这种特性能改变传染病的诊断。”

（生物通：万纹）

原文检索：

J.S. Gootenberg et al., “Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2,” Science, doi:10.1126/science.aam9321, 2017.