lncRNA ANRIL调节VEGF表达、糖尿病视网膜病变治疗新思路

lncRNA ANRIL在心血管疾病、II型糖尿病、青光眼、颅内动脉瘤和癌症中均有作用，作者通过体内和体外实验证明高糖导致在视网膜内皮细胞中的ANRIL上调，及分析ANRIL对VEGF表达的调节作用和在糖尿病性视网膜病变中的作用。该文lncRNA研究线路清晰完整值得一看。

　　

过去曾被认为是基因组的"暗物质"的长片段非编码RNA (lncRNAs)，已被发现在各种生物过程中发挥关键作用。LncRNA ANRIL位于一个冠状动脉疾病和II型糖尿病的遗传易感位点。研究人员通过在体内和体外分别检测LncRNA ANRIL对血管内皮生长因子（VEGF） 的调节作用，从而探究ANRIL 在糖尿病引起的视网膜病变中所扮演的角色。

研究背景
糖尿病引起的视网膜病变是50岁以上的个体中最常见的致盲原因，影响三分之一的糖尿病患者。它是一种慢性血管并发症，其特征为低度炎症，血清通过微血管渗漏，血管通透性增加，最终导致新生血管形成和形态改变。虽然在过去的十年中，早期诊断和预防方面已经取得了一定进展，然而，在这种并发症导致视网膜中的功能和结构改变仍然是一个重大的挑战。内皮细胞（EC）是高血糖损伤的主要目标，在高血糖状态下经历渗透性增加，重塑和表型改变，这个过程中有各种血管活性因子参与血管生成。然而，在内皮细胞中的VEGF信号传导代表了该过程中的一个主要限速步骤：响应提高的氧化应激的诱导，VEGF结合并激活酪氨酸激酶受体VEGFR-1和VEGFR-2。由于VEGF的产生可以在转录和转录后水平上受到调节，这可能成为一种治疗思路的切入点。

哺乳动物系统中的转录调节的关键特征在于：染色质响应细胞外和内在信号，在“活性”和“非活性”状态之间的动态转换。这些信号包括作为主要表观遗传学介质的组蛋白和DNA修饰，还有新增的多种RNA分子：包括miRNA和长片段非编码RNA（lncRNA）。新一代测序技术引发的DNA / RNA测序技术的进展，已明确了许多非编码RNA （ncRNA）分子具有影响生理和疾病的重要调节作用。lncRNAs已被证明在各种生物过程如转录，翻译，剪接和细胞内/细胞外运输呈递中具有重要性。并且，非编码基因组也受突变的影响。lncRNAs中的突变与诸如癌症，神经变性疾病和遗传疾病等疾病相关。

lncRNA ANRIL（INK4基因座的反义RNA）最初从家族性黑色素瘤患者中鉴定出来的，已经成为心血管疾病的潜在靶点。已知它与糖尿病，开角型青光眼和各种癌症有关。ANRIL由19个外显子组成，跨越126.3kb并产生3.8bp的RNA。它位于p15/CDKN2B-p16/CDKN2A-p14/ARF基因簇中。ANRIL的过表达也已经证实可调节组蛋白乙酰化因子p300。有报告指它在特定miRNA的表观遗传沉默中也发挥作用。

研究思路
这项研究的主要目的是确定由葡萄糖诱导的lncRNA的改变，以及其介导的糖尿病视网膜病变发病机制中的基因转录的改变。内皮细胞是葡萄糖诱导的损伤的主要目标，血管内皮生长因子是受ANRIL调节的下游分子。因此，使用HREC研究ANRIL表达中的改变及其对VEGF表达和功能的影响。

Western大学的研究人员对人类视网膜内皮细胞（HRECs）进行高糖培养以模拟糖尿病状态，然后用siRNA干扰“敲除”这些视网膜内皮细胞（HRECs）中ANRIL的表达，并与不用siRNA干扰的对照进行比较。另外还对ANRIL基因敲除小鼠进行链脲霉素诱导糖尿病，与不诱导的ANRIL敲除小鼠对照进行比较。

研究人员分别测量细胞和组织中的VEGF mRNA和蛋白质表达，并通过对血管形成，细胞增殖和视网膜血管渗透性测定来确定各种条件下VEGF功能的改变。通过PRC2阻断剂，siRNA和RNA免疫沉淀（RNA-IP）分析等方法，作者证实了ANRIL与PRC2（polycomb repressive complex 2）组分和p300的相互作用介导的对血管内皮生长因子的调节。

方法和结果
1.葡萄糖水平可调节ANRIL表达
使用5mM d-葡萄糖（NG）葡萄糖水平作为对照，将人视网膜内皮细胞暴露于25mM d-葡萄糖（高糖）环境，在不同时间点检测。结果观察到高糖诱导VEGF表达的升高呈现出时间依赖性方式，在48小时时具有最高表达，对HREC进行的微阵列分析显示ANRIL升高2.5倍。结果通过实时RT-PCR验证。然而，在25mM 1-葡萄糖（左旋葡糖，渗透控制）孵育后没有观察到显著的ANRIL改变。文章采用ArrayStar的定制芯片服务，能很方便地检测lncRNA的变化。免费索取康成生物ArrayStar lncRNA芯片的临床研究成果案例

对ANRIL进行RNA FISH以检查其细胞分布并检测其亚细胞定位。使用由34个互补寡核苷酸组成的定制设计的RNA FISH探针（Biosearch Stellaris FISH定制探针），每个20个碱基长并用3'末端荧光标记物标记。这种方法已被证明对RNA检测具有高度特异性。通过荧光原位杂交技术证实了葡萄糖诱导的ANRIL表达上调，但其亚细胞分布没有发现变化。原位荧光杂交显示ANRIL主要定位在核包膜的胞质侧周围。有趣的是，这有别于此前报告显示ANRIL在胃癌中呈核表达。lncRNA在不同细胞中的表达模式存在差异性，特别是定位差异，其原因是什么？还不得而知。

2.ANRIL对葡萄糖诱导的VEGF的表达和功能有调控作用

ANRIL已知能够与PRC2复合物相互作用，而PRC2复合物调节VEGF表达。通过在HREC中使用siRNA敲低ANRIL水平，可探究ANRIL在VEGF调节中的作用。VEGF在mRNA和蛋白水平上调是内皮细胞暴露于高水平葡萄糖的特征之一。这种上调在ANRIL siRNA转染后被阻断，从而显示出二者之间有直接的调节关系。研究人员还用内皮细胞血管生成分析检测了VEGF介导的血管生成作用，通过沉默ANRIL可阻断由葡萄糖诱导的血管形成增加，这种阻断又可以通过与VEGF孵育来逆转。 WST-1测定进一步表明，与对照相比，siANRIL转染的细胞中细胞增殖受到抑制。同样的，VEGF孵育可提高siANRIL转染的细胞在低糖和高糖培养基中的细胞增殖能力。

3.在ANRILKO小鼠中，糖尿病引起的症状被阻断，视网膜VEGF表达上调也被阻断
研究人员还使用ANRILKO小鼠模型（ANRIL敲除小鼠模型）。用STZ诱导野生型和ANRIL敲除小鼠的糖尿病。野生型糖尿病小鼠表现出高血糖症，多尿，糖尿和减少体重增加，而STZ诱导的ANRIL敲除小鼠的这些参数除了尿量之外都没有受到影响。研究人员检查了来自糖尿病和对照动物的视网膜组织，并分析ANRIL和VEGF表达。在野生型糖尿病动物的视网膜中观察到ANRIL上调，VEGF mRNA和蛋白水平升高；而在ANRILKO糖尿病小鼠中所有这些变化都没有发生！

外渗的IgG是增加通透性——也就是VEGF的功能性作用的标志物。高血糖在野生型糖尿病小鼠中引起的视网膜微血管通透性增加（评分3，与野生型对照中的评分0相比），而糖尿病ANRILKO小鼠（评分1）。这些观察表明ANRIL具有调节VEGF表达、在糖尿病性视网膜病变中的发挥作用。

4.ANRIL通过PRC复合物导致VEGF上调
有研究表明葡萄糖诱导的VEGF上调是通过PRC2复合物发挥作用的。PRC2是转录抑制复合物PRCs（PRC1和PRC2）的一部分，并且由许多亚基（例如EZH2，EED，SUZ12和RpAp46/48）。这些复合物在CDKN2A/B基因位点的表观遗传调控中至关重要。那么，ANRIL与糖尿病视网膜病变中的PRC2复合物有没有什么关系呢？实验结果表明，在暴露于高糖的HREC中、在糖尿病动物的视网膜中检测到EZH2的表达上调。而ANRILKO敲除小鼠导致EZH2水平的显著下调。EED表达水平类似地改变，而SUZ12水平保持不受影响。为了确定因果关系，研究人员还使用广谱甲基化酶阻断剂DZNEP来抑制PRC2活性。 PRC2复合物的所有组分被该甲基化酶阻断剂抑制。这种阻断导致VEGF和ANRIL的mRNA表达水平降低，表明PRC2对ANRIL和VEGF也具有调节作用。

5.ANRIL通过p300和miR200b起作用
早前的研究表明，VEGF通过p300也受miR200b的调节。有趣的是，研究人员发现使用siRNA干扰ANRIL表达而导致由葡萄糖诱导的p300上调得到修正。相比对照和糖尿病小鼠的视网膜组织，ANRILKO敲除小鼠也显著降低p300的表达。这些研究结果表明ANRIL能够调节糖尿病视网膜病变中由葡萄糖介导的p300增加。

那么p300对ANRIL有没有反馈调节呢？通过在HREC中沉默p300（这种沉默导致p300 mRNA表达减少约75％），可观察到该改变对ANRIL表达没有影响。 另一方面，ANRIL沉默也减少了葡萄糖诱导的miR200b下调。通过对HREC的RNA-IP分析（RNA免疫沉淀采用Millipore的Magna RIP RNA结合免疫沉淀试剂盒），进一步确认ANRIL与PRC2和p300的EZH2组分存在相互作用。 由针对EZH2和p300的特异性抗体进行免疫沉淀的样品，采用实时RT-PCR可测定ANRIL表达水平。当暴露于高葡萄糖水平时，ANRIL与p300的结合显著升高。 在高糖条件下EZH2与ANRIL的结合也增加。这些数据表明当暴露于高水平的葡萄糖时ANRIL直接结合p300和EZH2二者。

结论：高糖和糖尿病导致在HREC和视网膜中的ANRIL上调。利用siRNA来沉默由葡萄糖介导的ANRIL升高，可阻止VEGF表达。这种调节涉及ANRIL介导的对PRC2组分p300和miR200b的调控。在暴露于高浓度葡萄糖后，ANRIL与p300和EZH2(enhancer of zeste homolog 2, PRC2组分）的直接结合水平升高。

讨论

当前对增殖性糖尿病性视网膜病变的治疗通常是围绕激光光凝术、玻璃体-视网膜手术治疗。靶向转录过程将可能成为一种新的方法。ANRIL敲除小鼠就表现出几乎不受糖尿病症状影响。

虽然以前没有关于糖尿病视网膜病变ANRIL改变的报道，但最近有报告另一种lncRNA心肌梗死相关转录物（MIAT）在糖尿病视网膜病变中呈现出上调。在基因组中ANRIL上调的确切途径仍不清楚。长ncRNA也和编码基因一样受相同的调节过程。因此，高血糖诱导的氧化应激和随后的转录机制的改变也可能潜在地调节这种过程。

最后作者得出结论，在视网膜内皮细胞中，葡萄糖引起ANRIL的上调，并改变了VEGF表达和功能。ANRIL对VEGF的调节作用由ANRIL与PRC2复合物的组分和组蛋白乙酰化剂p300的相互作用介导的。这项研究的当前数据揭示了一种潜在的、有针对性的新方法，可用基于RNA的方法预防糖尿病视网膜病变。这篇文章对lncRNA研究线路清晰完整，值得一看。