CRISPR技术新突破：第一个CRISPR单核苷酸编辑成功的小鼠

　　

生物通报道：囊性纤维化，镰刀状细胞性贫血，亨廷顿氏舞蹈病和苯丙酮尿症都是由单个核苷酸（DNA的结构单元）发生突变而引起病症的疾病。人体DNA共有约30亿个核苷酸，分成四种类型：腺嘌呤（A），胞嘧啶（C），鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）。在某些情况下，仅仅一个核苷酸的差异都会造成严重的后果。科学家们能通过正确核苷酸替换错误核苷酸，来治愈这些疾病。但是要利用目前最热门的基因编辑工具：CRISPR-Cas9进行单个核苷酸替换，在技术上存在挑战。

近期来自韩国基础科学研究所IBS的研究人员利用了一种CRISPR-Cas9的变体，获得了具有单核苷酸差异的小鼠，这一重要的成果公布在2月27日的Nature Biotechnology杂志上。同期杂志上，中科院遗传与发育生物学研究所的高彩霞研究组也在利用Cas9变体（nCas9-D10A）融合大鼠胞嘧啶脱氨酶（rAPOBEC1）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI），构成了高效的植物单碱基编辑系统nCas9-PBE，成功地在三大重要农作物（小麦、水稻和玉米）基因组中实现高效、精确的单碱基定点突变。中国学者最新Nature Biotechnology发表Cas9变体单碱基编辑新成果

目前最流行的CRISPR-Cas9技术是在DNA双链的错误核苷酸上进行切割，切下来一小部分DNA片段，而IBS的这项最新研究则采用的是Cas9蛋白变体：nCas9，与一种称为胞苷脱氨酶的蛋白（即碱基编辑器）相融合，从而能将一个核苷酸替换为另一个核苷酸。

利用这种方法，不会出现DNA丢失，只是出现单个核苷酸被取代。这些脱氨酶是由哈佛大学的David Liu，神户大学的Keiji Nishda等人在其培养细胞系中开发和测试的，IBS研究组将其进一步推广到小鼠胚胎中。

研究人员分别改变了肌营养不良蛋白基因（Dmd），以及酪氨酸酶基因（Tyr）中的单个核苷酸，用以检验CRISPR-nCas9胞苷脱氨酶的融合。

研究获得了两方面的成功：携带Dmd基因单个核苷酸突变的小鼠胚胎，导致小鼠肌肉中无法产生dystrophin蛋白；另外一种是携带Tyr突变的小鼠，显示的病症是白化病性状。Dystrophin蛋白与肌肉肌营养不良症疾病相关，酪氨酸酶控制黑素的生成。

而且，这些单核苷酸取代也仅出现在靶标位置，这十分重要的，因为这意味着只有正确的核苷酸被取代。“我们首次在动物胚胎中成功实现了有效诱导碱基置换，产生了具有疾病表型的突变小鼠，这是一个原理验证实验，下一个目标将是纠正动物的遗传缺陷，并最终用于人类胚胎中的基因校正，”文章作者KIM Jin Soo表示。

（生物通：张迪）

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原文摘要：

Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos

Base editors (BEs) composed of a cytidine deaminase fused to CRISPR–Cas9 convert cytidine to uridine, leading to single-base-pair substitutions in eukaryotic cells. We delivered BE mRNA or ribonucleoproteins targeting the Dmd or Tyr gene via electroporation or microinjection into mouse zygotes. F0 mice showed nonsense mutations with an efficiency of 44–57% and allelic frequencies of up to 100%, demonstrating an efficient method to generate mice with targeted point mutations.