CRISPR女神最新Nature Biotechnology报道CRISPR-Cas9新进展

因在CRISPR-Cas9基因编辑技术方面获得重大突破而声名鹊起的Jennifer Doudna虽然在CRISPR专利案中暂时失利，但研究组成果不断，继去年年底开发了两套新型的CRISPR-Cas基因编辑系统，命名为CRISPR-CasX 和CRISPR-CasY之后，最近又在小鼠大脑中完成了有效的基因组编辑，为CRISPR-Cas9在神经细胞疾病中的应用再添一把火。

　　

生物通报道：因在CRISPR-Cas9基因编辑技术方面获得重大突破而声名鹊起的Jennifer Doudna虽然在CRISPR专利案中暂时失利（CRISPR专利最新消息：张锋赢了)，但研究组成果不断，继去年年底开发了两套新型的CRISPR-Cas基因编辑系统，命名为CRISPR-CasX 和CRISPR-CasY之后，最近又在小鼠大脑中完成了有效的基因组编辑，为CRISPR-Cas9在神经细胞疾病中的应用再添一把火。

这项最新研究公布在2月13日的Nature Biotechnology杂志上。

Cas9是一种由RNA导向的DNA结合和切割蛋白，能用于多种生物中，进行基因和非编码遗传元件的编辑修饰。目前Cas9介导的基因组编辑技术已经被应用到了眼、耳、肝和肌肉相关疾病的治疗中，但是组织特异性传递不理想依然是一个问题，这主要是因为几方面的原因，如直接整合到基因组DNA上，由细菌Cas9蛋白在编辑细胞中的持续表达引起的免疫应答和脱靶编辑。

一种解决方法就是利用非遗传编码，预组装和短寿命的Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物，在最新这篇文章中，研究人员为了检测体内Cas9 RNP的活性，首先对Ai9 tdTomato小鼠进行了改进，这种报告小鼠模型能提供位点特异性基因组编辑的高通量和定量序列读取，这种位点特异性基因组能令基因修饰细胞中的红色荧光蛋白获得功能信号。

研究人员研发出了一种单导向sgRNA，他们将其称为 sgRNAtdTom ，sgRNAtdTom能去除终止盒，激活细胞中的tdTomato表达。之后他们利用这种sgRNAtdTom RNP复合物对神经祖细胞（NPC）进行核转染后，通过显微镜和流式细胞术分析，研究人员观察到了一种RNP剂量依赖性激活，同时基因位点的NGS序列分析也表明Cas9 RNP诱导出现了插入或者缺失突变。

这些一系列的研究发现表明尽管tdTomato+细胞的数目低于报道过的RNP总基因编辑数量，但是tdTomato小鼠可以用于肉眼检测Cas9 RNP基因组编辑，并且可以在体内观察到编辑细胞。

通过这项研究，Doudna等人证实了在成体小鼠海马，纹状体和皮层中注射Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物，能完成小鼠大脑的有丝分裂后神经元的基因编辑，而且多个SV40核定位序列的Cas9编辑能将体内神经元编辑的效率提高十倍。

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作者表示，这些研究成果证明了Cas9 RNP介导的神经祖细胞基因组编辑可以用于体外，以及体内多个不同的大脑区域，虽然目前还不清楚4×NLS-Cas9-2×NLS RNP体内亲神经性（neurotropism）的具体机制，但是这可以用于神经元特异性靶向。由此说明这一技术未来可以用于治疗不同神经元的遗传神经系统疾病，纠正或灭活大脑神经系统疾病的潜在遗传因素。此外，研究也表明功能性Cas9 RNP可以以以非遗传编码方式，有效，精确和安全的递送到成体动物大脑的神经元上，解决了前文提出的问题，有助于未来利用Cas9-RNP复合物治疗神经性疾病，以及用于一般的组织特异性基因编辑。

Doudna致力于探讨了CRISPR-Cas9在各方面的应用，此前她也曾在Cell上发表综述，指出CRISPR-Cas9在医疗领域有着广阔的前景，可以用来矫正致病突变，治疗人类疾病。研究者们也在尝试用这一技术操纵生态群体，比如根据毒力或者抗性基因杀死相应的细菌、快速改变种群性状、控制入侵物种、改良主要农作物等等。这一技术将带领生物学研究进入一个新的时代。

（生物通：张迪）

原文摘要：

Efficient genome editing in the mouse brain by local delivery of engineered Cas9 ribonucleoprotein complexes

We demonstrate editing of post-mitotic neurons in the adult mouse brain following injection of Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes in the hippocampus, striatum and cortex. Engineered variants of Cas9 with multiple SV40 nuclear localization sequences enabled a tenfold increase in the efficiency of neuronal editing in vivo. These advances indicate the potential of genome editing in the brain to correct or inactivate the underlying genetic causes of neurological diseases.