Western Blot一定要用看家蛋白做内参？NO！还可以是总蛋白

期刊杂志对Western Blot文章发表的要求越来越严，这些要求包括如何确保Western Blot的重复性、定量的准确性、均一化方法的选择等。Nature、JCB、JBC等杂志明确规定Western Blot进行均一化时，要求选择不受实验条件影响的方法；JBC甚至还建议优先选择总蛋白进行均一化。今天基因小编就对Western Blot均一化方法做一简单总结与分析。

　　

什么是均一化呢？

Western Blot均一化是指：将目标蛋白信号÷上样对照信号得到均一化的数据，以此来校正不同样本之间、不同泳道之间的差异，以获得准确、可重复的Western Blot的结果。上样对照一般是稳定表达的内参蛋白，表达量不受环境、实验处理的影响。

均一化校正的是什么呢？

为什么要进行均一化呢？

均一化校正了样本之间的差异，保证了Western Blot检测到的数据是目标蛋白真实的数据。如果没有进行合适的均一化，不能确保获取的实验数据是真实的生物学差异还是实验导致的误差（如图一所示）。

图一：均一化校正了样本之间的差异，保证了Western Blot 检测到的数据是真实的生物差异而不是实验导致的误差。A图：未进行均一化的数据显示目标蛋白（红色）表达量差异较大，样本四表达量*低；B图：经内参蛋白（绿色）均一化后数据显示，样本之间蛋白表达量差异很小。

有哪些均一化方法呢？

比较经典的方法是用看家蛋白做内参进行均一化，看家蛋白又称管家蛋白，一般被认为在所有的组织中表达恒定且不受实验条件的影响，主要包括 Actin/Tubulin/GAPDH等，但是进一步的研究表明，在某些实验条件下，看家基因的表达会因不同类型的组织、不同的发育阶段、或不同的实验条件而变化。另外，用看家蛋白进行均一化需要注意信号饱和的问题，因为一般情况下看家基因表达丰度相对于目标蛋白丰度较高，两种蛋白可能存在不同的线性范围，为此实验人员往往需要调整上样量。因此为了确保更准确、客观的的均一化方法，有些研究人员、期刊杂志建议用总蛋白做Western Blot的均一化。

总蛋白染色---REVERT™ Total Protein Stain

总蛋白均一化是利用染料对胶上/膜上的总蛋白染色进行均一化，主要包括以下几种类型：不可逆结合染料法：如考马斯亮蓝染色法、Stain Free法等；可逆结合染料法：REVERT™ Total Protein Stain总蛋白染色法。考马斯亮蓝染色法操作简单但往往需要同时跑两块胶，一块胶进行染色另一块胶进行后续免疫试验，因为是对胶进行染色所以存在不能校正转印差异的问题；Stain Free等染料不可逆共价结合蛋白法，是对胶上或膜上总蛋白进行染色，由于与蛋白是共价不可逆结合，因此可能会影响抗体与靶蛋白的结合，并且在膜上的背景较高、线性范围也比较窄；LI-COR REVERT™ Total Protein Stain方法是对膜上总蛋白进行染色，因为是可逆结合所以不会影响后续抗体结合，不干扰Western Blot的检测，而且是在近红外波段成像背景较低，灵敏度较高，因此能够校正Western Blot的所有步骤，适用于任何生物条件下的实验，成像结果见图二。

哪种均一化方法*好？

没有哪一种均一化方法是*好的，因此需要了解每一种方法的特点以便选择一种符合您实验目的、生物学条件的均一化方法，以校正不同样本之间的差异，带给您准确、可重复、可发表的高质量数据。无论您选用哪种均一化方法，LI-COR Odyssey 近红外激光成像系统都能提供准确的结果。

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