尹长城教授：发表属于自己话语权的重要结构生物学成果

追沿着近年来国内学术“大神”们发表重要论文的轨迹，或多或少总是能翻出“结构生物学”这几个字，好似这已然成为了一条通道，一条通往顶级杂志的捷径。然而这些成果并是顺理成章，也不是通往论文发表的捷径，而是在茫茫浩瀚的生命科学海洋中抓住属于自己的标杆，是通过多年来数位学者付出的努力，掌握住我们的话语权。

　　

追沿着近年来国内学术“大神”们发表重要论文的轨迹，或多或少总是能翻出“结构生物学”这几个字，好似这已然成为了一条通道，一条通往顶级杂志的捷径。

就结构生物学来说，这门源自上世纪50年代DNA双螺旋结构的学科，自问世以来就令单薄的生物学生动了起来，并为之打开了一个崭新的世界，因此各国科学家趋之若鹜。中国的学者们以猪胰岛素晶体结构作为起点，近年来也在这一研究领域中开辟了一块属于自己的疆土，这不是顺理成章，也不是通往论文发表的捷径，而是在茫茫浩瀚的生命科学海洋中抓住属于自己的标杆，是通过多年来数位学者付出的努力，掌握住我们的话语权。

但说来容易做起来难，有时现实还会和你开玩笑，来自北大基础医学院生物物理学系的尹长城教授与中科院生物物理研究所的孙飞研究员近期取得了一项重要成果：他们应用冷冻电镜解析了钙离子激活的RyR1开放态4.2Å分辨率的结构，并由此揭示了钙离子激活的RyR1长程变构的结构机制，为理解RyR相关疾病提出了新的观点。原本他们将这一重要发现投向了Cell杂志，经过两轮审稿，三位审稿人基本通过了论文稿件，但最终由于意见相左，还是未能在Cell杂志上发表，“为了让国际钙信号转导领域的科学家了解中国科学家在该领域的贡献和我们在该领域应有的话语权，”尹教授等人选择在Cell Research通过“绿色通道”发表，并在投稿后5天作为封面文章公布。（尹长城、孙飞课题组重要成果登上Cell Research封面 ）

这项研究成果本身具有许多重要的意义，也为解释RyR通道的一些谜题带来不少新的观点。作为目前已知的最大离子通道蛋白，兰尼碱受体RyRs近年来随着技术的突破，获得了突飞猛进的进展，也成为各大顶级杂志青睐的焦点，尹教授2012年就策划了DHPR和RyR的三维结构研究，参与了RyR1三维结构解析，并与清华大学颜宁教授等合作于2015年应用冷冻电镜成功解析了RyR1关闭态3.8Å分辨率的结构（发表于Nature杂志），这项最新研究在之前基础上到底取得了哪些突破，回答了什么问题，技术上有哪些值得借鉴之处呢？就此生物通特采访了尹教授。

与肌肉收缩密切相连的RyR1
兰尼碱受体（ryanodine receptor，RyR）是肌肉细胞内的钙释放通道，因它和一种植物碱：兰尼碱具有很高的亲和力与特异性，故而得名。这类受体不仅与骨骼肌疾病，心肌疾病有关，而且与哮喘等多种疾病存在关联，因此备受科学家们的关注。

在哺乳动物中有三种RyR蛋白，其中RyR1主要分布在骨骼肌细胞中，与位于细胞膜上的L-型钙通道（DHPR）共同决定了肌肉兴奋-收缩偶联这一关键的肌肉运动基础，如果这一过程出现异常，就会导致严重的骨骼肌及心肌疾病，比如心肌梗死等致命性疾病。

当肌肉细胞接受来自与神经末梢的电脉冲信号后，首先导致细胞膜去极化，激活电压依赖的L-型钙通道，之前激活的L-型钙通道产生构象变化并将构象变化通过物理耦联传递到RyR而激活RyR通道，从而引起钙离子从肌浆网中释放，引发肌肉收缩。因此揭示了DHPR和RyR的三维结构和相互作用及其调控，就能阐明肌肉兴奋-收缩耦联分子机制，由此研发促进或者抑制之一过程的临床药物。

RyR1通道的门控机制
最新这项研究在RyR1关闭态的基础上，应用冷冻电镜解析了钙离子激活的RyR1开放态4.2Å分辨率的结构，这揭示了钙离子激活的RyR1长程变构的结构机制，发现了RyR1通道的门控机制和RyR1通道的离子选择性机制。

在总体分辨率达到4.9 Å，核心区域分辨率达到4.2 Å的钙离子激活RyR1开放态结构的基础上，研究人员将RyR1开放态结构与之前获得的关闭态结构进行比较，观察到了钙离子激活的RyR1长程变构门控机制。并进一步结构分析阐明了RyR1通道的门控机制和离子选择性机制。这些工作有助于人们进一步理解肌肉的兴奋-收缩偶联，对于RyR相关疾病的认识有重要意义，也为治疗相关疾病提供了重要的结构线索。

同期Cell Research杂志也发表了相关点评文章，国际RyR领域结构生物学专家Filip Van Petegem评价道，这些新的研究是解开RyR谜题的一大飞跃。

精彩问答

生物通：RyR1通道存在多种不同的关闭构象和多种不同的开放构象，您的这项最新发现揭示了在RyR1的生理配基钙离子作用下，RyR1长程（long-range）变构门控的机制，意义重大。您能给我们介绍一下这种长程变构的特点是什么吗？同期清华颜宁教授也发表了相关文章，指出了RyR1的中央结构域是长程变构门控通道开放的传感器，您的这项研究与其相承相辅，是否可以归总出此类变构的一个整体机制？

尹教授：RyR1是一个由12个结构域构成的巨大蛋白（图1），这12个结构域分属跨膜区、中央区和外周区（图2）。

图1：RyR1由12个结构域构成。
B为这些结构域在一级序列上的排列方式；
C为电镜密度图；
D为三维结构，显示12个结构域在RyR1的空间排列方式和相互作用(结构域以一级序列相同的涂色展示)。

图2 A：helical、handle、NTD，P1、P2为外围区；EF-hand、CTD、central为中央区；其余为跨膜区，其中S1-S4为VSL，S5为外螺旋，S6为孔道螺旋。

颜宁研究组的关闭态结构（1）和我们的开放态结构（2）揭示RyR1的所有结构域在空间上通过疏水或静电相互作用相互耦联。因此，RyR1上任何一个结构域发生构象变化，都可能通过空间耦联传递到跨膜区，引起跨膜区发生构象变化，从而打开通道。

由于中央区处于RyR1的中央，颜宁研究组在其开放态，把中央区描述为导致通道开关构象传递的“传感器”（transducer）。其实，中央结构域的作用是构像传递的中继站（relay station），即在构像传递中起“承上启下”的作用。真正的导致通道开关构象传递的传感器是中央结构域中的U-motif。

由于我们的开放态结构分辨率高，我们观察到钙离子激活RyR1时，首先导致中央结构域EF-hand的构象变化，该构像变化传递到中央结构域，由于U-motif位于中央结构域，所以中央结构域的构象变化导致U-motif发生构象变化。U-motif一方面和螺旋6相连的C-末端（CTD）偶联，另一方面和跨膜区的类电压敏感结构域（voltage-sensor like domain, VSL）耦联。因此，EF-hand1的构象变化通过中央结构域的U-motif经两条途径，即CTD和VSL传递到螺旋6，导致螺旋6发生构象变化，从而打开通道（图3）。

 
          图3：RyR1钙激活导致结构变化（A）和构象变化传递途径（B）

生物通：去年Nature杂志公布了三项RyR1结构研究上的重要进展（包括您参与的颜宁研究组文章），都提到了钙离子与EF-hand亚结构域对通道功能状态的可能影响。您的这项研究在其基础上进一步获得了突破，报道了钙离子激活的长程变构机制，那么这种变构过程中，EF-hand此类关键亚结构域发生了什么样的变化呢？

尹教授：去年的三篇文章描述的是RyR1关闭态的结构，对钙离子与EF-hand亚结构域的作用是一种推测，而且不知道钙离子的结合位点。

我们的开放态RyR1结构揭示，钙离子作用位点可能是是中央结构域的EF-hand结构域，而EF-hand1是钙激活位点。RyR1是通过钙离子结合到中央结构域的EF-hand1上，引发阶联式构象传递（cascade of conformational transmission），将构象变化经由中央结构域的U-motif传递到CTD和VSL，导致螺旋6发生构象变化，从而打开通道（图3）。

需要指出的是，Efremov文中（“Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor”）描述的RyR1开放态其实是抑制态，因为他们使用的钙离子浓度高达10 mM。在10 mM钙浓度，RyR1处于抑制态而非开放态。而我们使用的钙离子浓度是100 uM，在100 uM钙浓度下，RyR1处于最大的激活状态。

生物通：这项研究同时也提出了一种RyR1新型离子选择性机制，这对于整体RyRs研究来说具有开创性的意义，这种离子选择性的详细机制是什么？与其它钾离子通道和钠离子通道有何不同呢？

尹教授：对于已知的钾通道和钠通道，结构研究表明其选择性滤器序列（GGGXG）的排列与离子通道路径平行，四个亚单位该序列围成孔径的大小不随通道开关发生变化。因此人们提出，钾通道和钠通道的离子选择性是通过选择性滤器上的氨基酸残基上的氧原子与钾离子或水合钠离子通过配位发生相互作用而选择离子。类似的选择性滤器序列在RyR1中亦存在（GGGIG）。

但是我们的结构揭示，该序列在RyR1中的排列不是与离子通道路径平行，而是以锯齿状（zig-zag）方式排列，而且四个亚单位该序列围成的孔径的大小随通道的开关而变化。因此RyR1的离子不可能通过与选择性滤器氨基酸上的氧原子配位实现，因为配位要求参与配位的原子与离子形成严格的几何关系和固定的距离。

经分析我们发现在GGGIG的下面有两个带负电的氨基酸（GGGIGDE），因此我们推测RyR1是通过这些带负电的氨基酸产生的电场与钙离子发生相互作用而选择离子。这个推测与取代这两个带负电氨基酸会改变RyR1的离子选择性的分子生物学/电生理学证据吻合，而电场选择离子结合滤器大小可变则揭示了为什么RyR1不仅是一个钙通道，还是一个广谱的阳离子通道。

生物通：哺乳动物RyRs家族有三类亚型，您的这项发现是否也适用于其它两类通道？另外目前是否有研究介绍不同来源的RyR1，比如兔源的与人源的存在什么区别？

尹教授：序列分析表明RyR的三个亚型序列高度保守（>64%），而跨膜区和中央区的序列更加保守（>80%），只有外周区保守性低，有三个高度可变区域。冷冻电镜研究表明，所有RyR的三个亚型具有类似的构造，都是一个“蘑菇状”结构。因此，我推测所有三个亚型具有类似长程变构机制、门控机制和离子选择性机制。不同的是配体的调节机制，因为大部分配体结合在RyR的外周区域，不同亚型的调节配体亦不相同。

更多内容请参看尹教授实验室网页：http://medicine.bjmu.edu.cn

作者简介：

尹长城 北京大学医学部生物物理学系教授/系主任，北京大学工学院生物医学工程系兼职教授，中国生物物理学会理事/分子生物物理专业委员会委员，中国晶体学会理事/电子晶体学专业委员会委员，中国电子显微镜学会理事/冷冻电镜专业委员会副主任委员，北京大学生物医学工程一级学科博士点教授。

1982年毕业于吉林大学化学系；1985年在协和医科大学生物化学系获得硕士学位；1985年至1989年在清华大学生物科学与技术系任助教、讲师。1990年至1991年在瑞士苏黎士联邦理工学院（ETH）作访问学者；1991年至1992年在英国医学研究委员会伦敦国立医学研究院（MRC National Institute for Medical Research, NIMR）作访问学者；1992年至1997年在英国医学研究委员会剑桥分子生物学实验室（MRC Laboratory of Molecular Biology, LMB）攻读博士学位，于1998年获得PhD学位。1998年至2001年先后在英国设菲尔德大学分子生物学和生物技术系和伦敦大学Birkbeck学院结晶学系作博士后；2001年至2002年受聘于新加坡国立大学生命科学系任高级讲师。

参考文献
1.       Yan Z, Bai XC, Yan C, Wu J, Li Z, Xie T, Peng W, Yin CC, Li X, Scheres SH, Shi Y, Yan N.Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution.Nature. 2015 Jan 1;517(7532):50-5. doi: 10.1038/nature14063.
2.       Wei R, Wang X, Zhang Y, Mukherjee S, Zhang L, Chen Q, Huang X, Jing S, Liu C, Li S, Wang G, Xu Y, Zhu S, Williams AJ, Sun F, Yin CC.Structural insights into Ca(2+)-activated long-range allosteric channel gating of RyR1.Cell Res. 2016 Sep;26(9):977-94. doi: 10.1038/cr.2016.99.