专访尹长城教授：技术发展带来革命性突破

细心的读者或许已经发现，近几年结构生物学领域的许多重要成果都来自冷冻电镜（cryo-EM）。如今，冷冻电镜已经成为结构生物学领域炙手可热的研究工具。那么，冷冻电镜为何吸引了这么多生物学研究者的目光？技术突破又对结构生物学产生了怎样的冲击呢？生物通有幸邀请到冷冻电镜专家尹长城教授来和大家聊一聊。

　　

生物通报道：Ryanodine受体（RyR）是一类巨大的离子通道，介导多种细胞的钙离子信号传导，在肌肉的兴奋-收缩偶联中起到了关键性作用。不过，人们对RyR通道的激活和调控机制一直知之甚少。北大基础医学院的尹长城教授和中科院生物物理研究所的孙飞研究员最近在这方面取得了突破，他们领导团队通过冷冻电镜揭示了RyR1的长程变构门控机制。Cell Research杂志以封面文章的形式刊登了这项重要成果，还邀请国际RyR领域结构生物学专家Filip Van Petegem进行了评述。（延伸阅读：尹长城、孙飞课题组重要成果登上Cell Research封面，Cell Res点评尹长城教授新成果：如何打开RyRs）

细心的读者或许已经发现，近几年结构生物学领域的许多重要成果都来自冷冻电镜（cryo-EM）。虽然冷冻电镜与X射线晶体学、核磁共振并称为结构生物学的三大技术，但冷冻电镜过去一直是比较弱的一项。不过，如今冷冻电镜已经成为结构生物学领域炙手可热的研究工具，还被《Nature Methods》评为2015年最值得关注的技术之一。

每一次技术革新都会为相关领域注入强大的动力，CRISPR基因组编辑是这样，冷冻电镜也不例外。包括尹长城教授、孙飞研究员在内，我国研究者们已经用冷冻电镜取得了一系列重要进展，引起了国际生命科学领域的高度瞩目。“冷冻电镜的突破性进展给结构生物学研究带来革命性突破，”尹长城教授强调说。

那么，冷冻电镜为何吸引了这么多生物学研究者的目光？技术突破又对结构生物学产生了怎样的冲击呢？生物通有幸邀请到冷冻电镜专家尹长城教授来和大家聊一聊。

冷冻电镜是一种什么样的技术

尹长城教授介绍到：冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）是一种电镜技术，其核心是将含水生物样品（如蛋白质、病毒、细胞器、细胞）快速冷冻（冷却速率>10000度/秒），使之固定在一层玻璃态的冰中，理想厚度为刚好覆盖生物样品。由于冷冻速度极快，生物样品来不及发生变化即被固定，而且玻璃态冰是非晶态，不会对生物样品产生破坏作用。正因如此，生物样品保持在与溶液中相同的状态，即天然状态（native state）。快速冷冻后的样品通过特殊的转移装置转移到电镜下，生物样品始终处于冷冻的玻璃态的冰中。随后，一边保证样品始终处于玻璃态的冰中（一般采用液氮冷却），一边通过电镜进行图像采集。用计算机对采集后的图像进行图像处理和三维重构，就能获得所研究对象（如蛋白质、病毒、细胞器、细胞）的三维结构。

冷冻电镜技术获得了怎样的突破？

尹长城教授表示，近几年冷冻电镜在硬件和软件上的突破性进展，给结构生物学研究带来革命性突破。首先，新型电镜（Titan Krios）为高通量、高质量电镜图像数据采集提供了保证。该电镜是一种高电压（300千伏）场发射源电镜，采用三级聚光系统，大大提高了发射电子的相干性和平行性，提高了图像的分辨率，降低了图像的畸变。这种电镜采用机器手转移样品，样品与外界几乎完全隔绝，并连续保持在玻璃态冰中，既保持了样品的稳定性，又避免了晶态冰污染。这可以保证高通量、高质量图像的采集持续进行（几天甚至几周）。

第二，新型图像记录装置--直接电子探测器（direct detecting device, DDD）为高分辨数据的记录提供了保障。DDD由美国加州大学旧金山分校程逸凡和David Agard首次引入冷冻电镜（1）。DDD的量子检测效率（detective quantum efficiency, DQE）大大高于CCD，使得图像的衬度（contrast）和灵敏度 （sensitivity）大大提高，图像采集可以用比CCD低的放大倍数和电子计量。这不仅提高了图像采集的效率，更重要的是可对同一个视野采集多帧图像，从而对样品移动所造成的图像漂移进行矫正并叠加平均，大大提高了图像的分辨率。

第三，新型图像处理软件为图像处理和三维重构提供了有力工具。英国剑桥MRC分子生物学实验室Sjors Scheres研发的RELION图像处理软件功能强大而且齐全（2）。该软件最重要的功能是能对样品颗粒图像进行分类，然后对各个分类分别进行图像处理和三维重构。这不仅大大提高了三维重构的分辨率，还可对样品不同类的结构进行分析，得出生物大分子不同状态的结构，进而诠释生物大分子执行功能的机制。

（据悉，尹长城教授在研究中使用的是中科院生物物理所生物成像中心的FEI Titan Krios电镜，配备直接电子探测器Falcon III 和K2。）

成为与X-射线晶体学相媲美的技术

上述硬件和软件上的突破性进展，使冷冻电镜解析生物大分子的三维结构取得了质的飞跃，尹长城教授告诉我们。首先，冷冻电镜结构解析的分辨率已从纳米尺度进入埃尺度，即原子尺度，成为与经典结构解析手段（X-射线晶体学）相媲美的结构解析方法；第二，单颗粒冷冻电镜方法解析结构不用晶体，大大降低了结构解析的难度并提高了结构解析的速度；第三，冷冻电镜可在近生理溶液的条件下获得生物大分子的三维结构，使得结构与功能研究更加吻合；第四，冷冻电镜可同时获得生物大分子不同状态的结构，能够从结构上诠释生物大分子执行功能的机制；第五，冷冻电镜可用来研究生物大分子在细胞甚至组织原位的结构，使得在细胞内研究生物大分子的结构和相互作用成为可能。

冷冻电镜带来的机遇与竞争

近年来，冷冻电镜的突破使得原来难以研究的重要生物大分子及其复合物获得结构解析，它们执行生物学功能的机制也被逐步破解。尹长城教授及其同事今年八月在Cell Research杂志发表论文，借助冷冻电镜阐明了离子通道RyR1的长程变构门控机制。Cell Research同期还发布了清华颜宁研究组的研究成果，他们通过冷冻电镜得出了类似的RyR1作用机制。最终，尹长城教授等人的研究成果被选为封面文章。

结构生物学领域在冷冻电镜的推动下飞速发展，当然激烈的竞争也接踵而来。如何能在这场技术大潮中取得先机，恐怕是结构生物学研究者们面临的新挑战。

参考文献：
1. Li X, Mooney P, Zheng S, Booth CR, Braunfeld MB, Gubbens S, Agard DA, Cheng Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particlecryo-EM. Nat Methods. 2013 Jun;10(6):584-90. doi: 10.1038/nmeth.2472.
2. Scheres SH. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 2012 Dec;180(3):519-30. doi: 10.1016/j.jsb.2012.09.006.

生物通编辑：叶予

生物通推荐原文：Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1