Cell Stem Cell: 利用CRISPR实现细胞直接重编程

　　

生物通报道  研究人员利用一种革命性的遗传工程新技术：CRISPR，将从小鼠结缔组织中分离出来的细胞直接转变成了神经元细胞。这项研究发布在8月11日的《细胞干细胞》（Cell Stem Cell）杂志上。

2006年，京都大学前沿医学科学所的山中伸弥（Shinya Yamanaka）教授，发现了将成人结缔组织细胞——成纤维细胞逆转为可分化为所有细胞类型的不成熟干细胞的方法。因在研究和医学中显示出的前景，这些所谓的诱导多能干细胞让山中伸弥仅在6年后即获得了诺贝尔医学奖。

自那以后，研究人员已发现了其他的一些方法让细胞在不同类型之间转换。这主要是通过导入许多额外拷贝的“主开关”基因，生成一些蛋白开启负责生成一种特定细胞类型的整个遗传网络而做到的。

现在，杜克大学的研究人员开发出了一种策略避开了对额外基因拷贝的需求。通过利用一种改造版的CRISPR遗传工程技术直接开启了存在于基因组中的自然拷贝。

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这些早期的结果表明，新转化的神经元细胞比采用将新基因永久添加到基因组中去的方法显示更彻底、更持久的转化。这些细胞可以用来建立神经系统疾病模型，发现新疗法，开发出个体化药物，并有可能在未来实施细胞治疗。

杜克大学生物分子与组织工程学中心主任、生物医学工程学副教授Charles Gersbach说：“这一技术在科学和医学上有着许多的应用。例如，我们对于大多数人的神经元将会如何响应一种药物或许会有一个大概的印象，但我们并不知道你那具有特殊遗传学的特异性神经元将会如何响应药物。取得你的大脑活组织标本测试你的神经元并不可取。但如果我们可以从你的手臂取得皮肤细胞，将它转化为神经元，然后用各种药物组合来处理它，我们就可以确定一种最佳的个体化治疗。”

Gersbach实验室研究生Joshua Black说：“有效生成稳定，且与你的真正神经元具有相似遗传编程的神经元是一个挑战。这一直是该领域一个重要的障碍。”

在上世纪50年代，作为发育生物学奠基人物的英国发育生物学家Conrad Waddington提出，可以将不成熟的干细胞分化为特定成体细胞类型视作为，沿着脊形山脉一侧向下滚到众多山谷其中的一个里面。每一条路径细胞都走下一个特定的斜坡，其最终目的地的选项变得更加的有限。

如果你想改变目的地，一种选项就是将细胞垂直推回到山上——这就是重编程细胞成为诱导多能干细胞背后的想法。另一种选项就是将它水平向上推，翻过一座小山，直接进入到另一个山谷中。

Gersbach说：“如果你能特异地开启所有的神经元基因，也许你就无须回到山上。”

以往的一些方法是通过导入病毒，注射额外基因拷贝来生成称作为主转录因子的大量蛋白做到这一点的。这些蛋白结合基因组中成千上万的基因，开启了细胞类型特定的基因网络，这对于每种细胞类型而言都是独特的。但这种方法具有一些缺点。

Black说：“不再采用一种病毒永久地导入存在基因的新拷贝，而是提供一个暂时的信号以一种稳定的方式来改变细胞类型将是可取的。然而，要以一种有效的方式做到这一点，可能需要对细胞的遗传程序做出一些非常特异的改变。”

在新研究中， Black、Gersbach和同事们采用了CRISPR来精确激活自然生成重要转录因子控制神经元基因网络的三个基因，而没有使用病毒导入这些基因的额外拷贝。

CRISPR是靶向和切分熟悉入侵病毒DNA的一个细菌防御系统的改良版本。在本案例中，这一系统经调整不再涉及切割。转而，识别特定DNA片段的机器完好无损，它与一个基因激活子连接在一起。

研究人员用这一CRISPR系统处理了实验室中的小鼠成纤维细胞。测试结果表明，一旦被CRISPR激活，三种神经元主转录因子基因会强有力地激活神经元基因。这使得成纤维细胞传导了一些电信号——这是神经元细胞的一个标志。甚至在CRISPR激活子停止作用后，这些细胞仍保持它们的神经元特性。

Gersbach 说：“当用病毒生成的主转录因子冲击细胞时， 有可能让一些细胞表现得像神经元。但如果它们已真正成为了自主运作的神经元，那它们不应该需要持续存在这些外部刺激。”

实验表明，新的CRISPR技术生成的神经元靶基因上的一种表观遗传程序与天然存在于小鼠脑组织中神经元标记相匹配。

根据Black所说，接下来将把这一方法扩展的人类细胞中，提高这一技术的效率，尝试清除其他的一些表观遗传障碍，使得它可以用于建立一些特定疾病的模型。

Gersbach 说：“在未来，你可以想象生成神经元，并将它们移植到大脑中去治疗帕金森病或其他神经退行性疾病。即便我们走不到那么远，你还可以利用它们在实验室做许多事情，以帮助开发出更好的疗法。”

近年来，Gersbach领导课题组在CRISPR研究中取得不少引人注目的成果。2015年2月，Gersbach和杜克大学的研究人员设计出了一种方法，通过结合一种细菌的病毒防御系统CRISPR/Cas9及花对于阳光的反应，只需拨动光开关就可以在实验室培养皿中以任何模式在任何的特异位点激活基因。这一成果发布在Nature Chemical Biology杂志上（Nature子刊发布光诱导CRISPR新技术）。

2015年4月，杜克大学的Gersbach研究小组开发出了一种新方法，可以精确地控制基因开启及激活的时间。借助这一新技术研究人员可通过化学操控包装DNA的蛋白，来开启特异的基因启动子和增强子——控制基因活性的基因组片段。这项研究发表在Nature Biotechnology杂志上（Nature子刊：用CRISPR操控表观基因组 ）。

一些研究表明，采用CRISPR/Cas9系统来编辑人类DNA序列并不总是如研究人员想象的那样精确。这些结果对利用CRISPR技术来研究人类疾病提出了担心。作为一种潜在的解决方案，研究人员通过采用CRISPR靶向控制基因活化的DNA区域来增加了这一系统的通用性。虽然这一技术已被证实能够很好地起作用，但尚未调查其是否具有脱靶效应。2015年10月，Gersbach领导杜克大学的一个研究人员小组证实，这些基因控制方法能够达到基础科学和医学研究所需的高精确度。这项研究发表在Nature Methods杂志上（Nature Methods：用CRISPR高度精确控制基因表达 ）。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文索引：

"Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells." Joshua B Black, Andrew F Adler, Hong-Gang Wang, Anthony M D'Ippolito, Hunter A Hutchinson, Timothy E Reddy, Geoffrey S Pitt, Kam W Leong, and Charles A Gersbach. Cell Stem Cell, 2016. DOI: 10.1016/j.stem.2016.07.001