中美科学家用CRISPR制备肾癌模型

6月30日，Nature子刊《Scientific Reports》在线刊登了加州大学洛杉矶分校、华中科技大学同济医学院的一项最新研究成果。这项研究采用CRISPR基因组编辑技术，来制备转移性肾细胞癌的小鼠模型。

　　

生物通报道：转移性肾细胞癌（mRCC）几乎是无法治愈的，是RCC有关的高死亡率的主要原因。Von Hippel Lindau (VHL)是一个肿瘤抑制基因，在大多数的透明细胞RCC（ccRCC）病例中是缺失的。然而，它对于缺氧诱导因子-1α(HIF-1α) 和 -2α (HIF-2α)的调控发挥了什么作用，还没有得到很好的研究。

6月30日，Nature子刊《Scientific Reports》在线刊登了加州大学洛杉矶分校、华中科技大学同济医学院的一项最新研究成果，题为“CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma”。这项研究的通讯作者是加州大学洛杉矶分校的华裔教授吴若萍（Lily Wu）。华中科技大学同济医学院的Hua Xu、Wei Guan等人是本文共同作者。

mRCC的治疗方案是有限的，因为这种肿瘤对传统化疗和放疗表现出耐药性。治愈这种疾病的一种疗法是白介素-2（IL-2）疗法，但是只作用于大约7%的患者。最近发展起来的靶向疗法——包括靶定免疫检查点抑制剂程序性细胞死亡-1（PD-1）的疗法，表现出一定的功效。但是，还缺乏持久的干预措施来对抗mRCC，从而迫切需要一种疾病模型，并深入了解这种疾病的驱动机制。

我们对于ccRCC的了解来自于对肿瘤抑制基因VHL的研究。遗传性的VHL综合征病例表现出ccRCC的发展风险升高。随后的研究表明，这个基因在高达90%的散发性ccRCC病例中是沉默的。VHL通过识别和靶定缺氧诱导因子（HIF-1α, HIF-2α和HIF-3α）的α亚基用于泛素化和降解，而调控着缺氧反应。在低氧条件下，VHL不能识别HIF-αs，它们通过与HIF-1β结合来易位到细胞核中，并制定缺氧反应所必需的转录程序。

研究人员试图通过敲除VHL，来制备ccRCC的小鼠模型。最近的研究表明，除了VHL之外，Bap1的缺失可有助于更一致地制备ccRCC小鼠模型。虽然其中一些研究显示出早期囊性ccRCC变化和局部肿瘤的迹象，但是这些研究无法产生这种疾病的侵袭性、转移性形式。为此，许多研究都依赖于RENCA模型，最广泛使用的RCC免疫活性小鼠模型。尽管这种小鼠模型的效用已经得以证明，但是科学家们最担心的问题是，其在野生型VHL表达中的临床适用性。

以前的研究表明，VHL缺失可促进一种更具侵袭性和转移性的肿瘤模型。有大量研究表明，靶定VHL功能可能导致一小部分的上皮间质转化（EMT）。这个过程已被确定为一个中心节点，肿瘤通过这个过程从它们的原发部位转移到身体其他部位。EMT涉及到细胞间接触的减少，以及从上皮细胞基底膜上脱离，转化为一种更为移动性和侵袭性的细胞类型。这些表型变化的同时，是各种各种的分子变化，包括上皮标记的缺失，例如在临床ccRCC标本中常见的E钙粘素，还有一些间叶细胞标记的获得，例如N钙黏着蛋白和α-SMA。值得注意的是，许多研究证明了HIF-1α对于推动这些变化的作用。此外，HIF-1α已被证明可在其他肿瘤转移模型中导致转移。这些结果表明，在RENCA 模型中删除VHL，可能会产生一种更具转移性的临床相关模型。

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CRISPR基因操纵方法最近已被用于常规实验室研究。这一突破性的基因敲除技术，因为易用性和完全敲除基因功能的有效性而著名。基于酿脓链球菌适应性免疫系统，这种以RNA为基础的基因组编辑技术，已迅速在许多生物研究中证实了其效用。研究人员开发出CRISPR方法，是为了生成基因敲除小鼠，在细胞系中进行全基因组筛查，在小鼠体内敲除基因，并在体内筛查转移性的基因。然而，迄今为止，很少有研究证明CRISPR介导的小鼠细胞系修改，来生成改进的可移植小鼠肿瘤模型。

在这项研究中，研究人员利用CRISPR基因组编辑工具，敲除RENCA细胞中的VHL表达。他们发现，在RENCA模型中，CRISPR / Cas9介导的VHL敲除，可导致指示EMT的形态学和分子改变，进而驱动到肺部的转移增加。HIF-1α缺陷型的RENCA细胞，在VHL敲除后不能发生EMT。

RNA-seq显示，几个HIF-1α调控的基因，在VHL基因敲除的细胞中是上调的，它们的过度表达意味着，癌症基因组图谱(TCGA)数据库中一种更具侵袭性的ccRCC。在一个新的临床数据集中的独立验证证实，相对于邻近的正常组织，这些基因在ccRCC样本中是上调的。这些结果表明，VHL的缺失可能通过稳定RCC中的HIF-1α而驱动肿瘤细胞的传播。更好的理解这个现象背后的机制，可以指导科学家们寻找更有效的疗法对抗mRCC。

科学家们对肾癌这种疾病进行了深入的研究。2014年8月，贝勒医学院带领的一个国际科学合作项目，发现了可能导致肾嫌色细胞癌的遗传学改变的线索，不仅为这种罕见癌症，也为其他类型癌症，提供了新的见解。相关研究结果发表在2014年8月21日的国际著名期刊《Cancer Cell》。相关阅读：测序揭示罕见肾癌的独特遗传变化。

2015年12月，Cell杂志的“SnapShot: Renal Cell Carcinoma”这篇文章总结了目前关于这种癌症基因全景图中的几个关键特征，主要途径，肿瘤演变和异质性等多方面内容，并且也介绍了肾细胞癌的相关治疗进展。相关阅读：Cell综述：肾细胞癌基因全景图。

今年3月份，贝勒医学院的一个研究团队深入分析了近900个肾癌样本。过去人们根据肾癌细胞在显微镜下的特征将肾癌分为三个大类。而这项研究表明，在分子水平上肾癌还可以进一步分为九个亚类。这些肾癌亚类各具特征，受到影响的分子通路和患者的生存情况也大相径庭。相关阅读：最大规模肾癌基因组研究。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma
Abstract: Metastatic renal cell carcinoma (mRCC) is nearly incurable and accounts for most of the mortality associated with RCC. Von Hippel Lindau (VHL) is a tumour suppressor that is lost in the majority of clear cell RCC (ccRCC) cases. Its role in regulating hypoxia-inducible factors-1α (HIF-1α) and -2α (HIF-2α) is well-studied. Recent work has demonstrated that VHL knock down induces an epithelial-mesenchymal transition (EMT) phenotype. In this study we showed that a CRISPR/Cas9-mediated knock out of VHL in the RENCA model leads to morphologic and molecular changes indicative of EMT, which in turn drives increased metastasis to the lungs. RENCA cells deficient in HIF-1α failed to undergo EMT changes upon VHL knockout. RNA-seq revealed several HIF-1α-regulated genes that are upregulated in our VHL knockout cells and whose overexpression signifies an aggressive form of ccRCC in the cancer genome atlas (TCGA) database. Independent validation in a new clinical dataset confirms the upregulation of these genes in ccRCC samples compared to adjacent normal tissue. Our findings indicate that loss of VHL could be driving tumour cell dissemination through stabilization of HIF-1α in RCC. A better understanding of the mechanisms involved in this phenomenon can guide the search for more effective treatments to combat mRCC.