遗传学大牛用CRISPR/Cas识别SNPs

最近，哈佛大学医学院著名遗传学家George Church带领的研究小组，使用CRISPR/Cas来识别SNPs。相关结果发表在生命科学预印本网站BioRxiv上。

　　

生物通报道：随着基因组编辑系统的发展，没有什么比CRISPR/Cas更简单的了。然而，在实践中，将该系统限定于预期的位点可能是具有挑战性的，尤其是两个或两个以上的位点只有一个单碱基差异的情况。哈佛大学Wyss生物启发工程研究所的Benjamin Pruitt指出：“Cas9是杂乱的。在许多情况下，它将高效地切割两个等位基因。”这是生物医学中的一个问题，因为研究人员设想修复受损的基因拷贝，而单独留下野生型基因。

现在，Pruitt与哈佛大学医学院著名遗传学家George Church实验室的临床研究员Alejandro Chavez合作，为这个问题设计了一个潜在的解决方案，发表在生命科学预印本网站BioRxiv上，George Church是本文的共同通讯作者。

Cas9可以承受引导性RNA和靶序列之间的单个不匹配，但它可能无法承受更多。因此，该研究小组设计了一个引导性RNA筛查，使用引导性RNA——每个包含两个相对于野生型序列的突变，可切割赋予耐药性的一个特定突变，但它并非也切割野生型等位基因。一旦靶标突变成了不希望得到的序列，向导将仅通过一个单一不匹配而被关闭，从而使得Cas9切割和抑制不希望得到的副本。

该研究团队首先将该策略应用到β-内酰胺酶基因的一个特定突变，在高度致突变的背景中，这个基因编码氨苄青霉素的耐药性。含有一段对照引导性RNA的细胞，在氨苄青霉素上快速生长，而含有一个双突变体“调整向导RNA”（tgRNA）的细胞则没有。在这些细胞中，不需要的突变的出现，可诱导快速裂解，从而将该基因去除。

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研究人员接下来将相同的方法应用链霉素和利福平耐药性的研究，表明该策略不仅适用于靶定大肠杆菌染色体本身，也可能是多路复用的。他们还表明，该策略可以在小鼠胃肠道的复杂环境中发挥作用。

据Chavez说，这种方法——应该转化到更高级的生物中，在基因治疗、合成生物学和进化生物学以及其他领域，都有潜在的应用价值。例如，它可用来确保转基因细菌不会获得特异性的不理想性状，或用来研究有机体在常见逃生通路被切断时的应激反应。只需要一组候选引导性RNAs——在这种情况下是27个。Chavez说：“那不是很贵。这很辛苦，但不是很贵。”

George M. Church是哈佛医学院著名的遗传学教授、Wyss研究所的核心成员，被誉为是个人基因组学和合成生物学的先锋。1984年，Church和 Walter Gilbert发表了首个直接基因组测序方法，一些策略现在仍应用在二代测序技术中。此外，他还发明了多重化分子技术和条码式标签，并作为纳米孔测序技术的发明者之一。

2014年9月，George M. Church教授领导哈佛医学院的团队，开发了单分子互作测序（SMI-Seq）技术，该技术能够实现单分子水平上的并行分析，获得大量蛋白质的互作图谱。相关阅读：遗传学大牛Nature发表新技术：单分子互作测序。随后的11月，他领导哈佛医学院的团队，在人iPS细胞中进行了CRISPR基因编辑。他们将全基因组测序和靶向深度测序结合起来，鉴定了Cas9编辑iPS细胞时的脱靶效应，还鉴定了一个影响Cas9特异性的单核苷酸变异（SNV）。这项研究发表在Nature Communications杂志上。相关阅读：遗传学大牛最新文章：CRISPR编辑iPS细胞的脱靶情况。

就基因表达而言，人们主要还是一次研究一个基因。去年3月，哈佛大学Wyss研究所的研究人员在George Church的领导下利用CRISPR/Cas9系统开发了一种革命性技术。该技术可以揭示一连串基因回路对生物过程的影响，也可以精确指导干细胞分化，生成再生医学所需的移植器官。相关阅读：著名遗传学家获重要突破：Cas9随心所欲地激活基因。随后的7月份，该研究小组开发出了一种预测软件，可以准确找出最有效的方法利用CRISPR-Cas9基因编辑技术来实现基因打靶。这项重要的研究成果发布在《自然方法》（Nature methods）杂志上。相关阅读：遗传学界大牛Nature子刊发布CRISPR-Cas9新工具。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Precise Cas9 targeting enables genomic mutation prevention
ABSTRACT: Here we present a generalized method of guide RNA “tuning” that enables Cas9 to discriminate between two target sites that differ by a single nucleotide polymorphism.  We employ our methodology to generate a novel in vivo mutation prevention system in which Cas9 actively restricts the occurrence of undesired gain-of-function mutations within a population of engineered organisms. We further demonstrate that the system is scalable to a multitude of targets and that the general tuning and prevention concepts are portable across engineered Cas9 variants and Cas9 orthologs. Finally, we show that the designed mutation prevention system maintains robust activity even when placed within the complex environment of the mouse gastrointestinal tract.