CRISPR遗传筛选：eSpCas9 突变

　　

生物通报道：基因编辑，尤其是CRISPR/Cas9系统，从某种意义上来说就像是一辆正在生产的闪亮新车，在构建主要框架的同时也开始启动，而且还准备开始一路飚车。

自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因编辑之后，这个前途光明的技术已经被应用到了许多研究领域，而且随着技术的改良，越来越多的研究团队利用CRISPR进行大规模的遗传筛选，比如用于识别导致癌症抵抗治疗的突变，或者加速药物靶标评估。RNA干扰，相比于CRISPR/Cas9 在遗传筛选方面的作用，无论是效率和特异性方面，目前都难以望其项背了。

同时，譬如MD安德森癌症中心等处的研究人员也开始进一步了解CRISPR/Cas9的特性和局限性，了解它到底能做些什么，比如分析人类细胞系。CRISPR/Cas9 工具箱不断的扩大，Broad研究院的张锋等人也开始利用Cas9结合到基因组上，停止或者加强转录。这些CRISPR领衔科学家对于CRISPR/Cas9在遗传筛选方面的作用，有何看法呢？

张锋
Broad研究院核心成员
哈佛Keck职业发展教授

张锋研究组曾在“Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity”这篇文章中，探讨了从化脓性链球菌中改变了组成Cas9酶的1400个氨基酸中的3个氨基酸，从而将基因编辑中脱靶效应降低到了几乎无法检测的水平的可能性。当RNA 与DNA 不是那么配对的时候，Cas9内切酶会诱导脱靶突变，导致这无法成为临床试验中的精确基因编辑。

为了能容纳下Cas9蛋白，DNA链需要分开，张锋研究组进行了结构分析，发现在Cas9蛋白位点的负电荷非靶标DNA上有一个合适的正电荷凹槽。“我们认为如果能中和部分正电荷，就能消弱稳定性，从而能Cas9更具特异性，”张锋说。

他们利用已知定位在特殊脱靶位点上的导向RNAs来进行了这个方法的实验，研究组构建出了Cas9的32个单突变，然后将每个突变通过EMX1基因有效，但容易出现错误的导向RNA，靶向EMX1。

结果发现其中五个能完成EMX1基因的基因编辑，但是会十倍比率的减少脱靶位点的切割，之后研究人员又尝试利用Cas9突变去切断另外一个基因：VEGFA，这种基因已知能在两个之前识别的脱靶位点上进行切割。虽然所有的Cas9突变都减少了脱靶效应，但是研究人员认为他们应该结合这些突变，让Cas9更加特异性。因此他们利用三点突变体（triple-point mutations）产生了两个不同的突变，发现“我们能完成靶向激活，并进一步减少脱靶活性，”张锋说。

张锋将这些增强版的特异性Cas9蛋白称为“eSpCas9 突变”，研究组成员用一个三点突变和一点突变eSpCas9检验了许多导向RNAs，从中发现这两者在编辑靶向位点时具有相似的效率，不过一些突变与不同导向RNAs配对使用会出现一些效率的差别。“平均来说，这些突变和野生型Cas9平齐，”张锋说。

此外，研究组也结合野生型 Cas9组合进行了多种导向RNAs突变的尝试，结果在导向RNAs的3'末端（特异性导向处）发现有一种所谓“种子区域”（seed region，生物通译）。相反，新的eSpCas9 变种会将这一区域延伸到整个导向RNAs，而且这也会令这一系统更加特异性。