同济大学、温州医科大学发表文章解析CRISPR基因编辑系统

　　

    CRISPR/Cas9系统是目前进行基因编辑的有效技术。实现CRISPR/Cas9系统的核心问题之一是进行高效以及特异性的sgRNA设计。基于CRISPR/Cas9的基因敲除通常介导非同源性末端链接的DNA修复机制(NHEJ), 在某些特殊情况下，如序列存在微同源模式特征（microhomology pattern）的情况下，可能会触发微同源末端介导的DNA修复机制(MMEJ)。关于microhomology pattern和CRISPR系统产生indel中的in-frame mutation 发生率之间的关系，是该领域内一个重要而又开放的问题。In-frame mutation发生率直接影响到sgRNA的cleavage efficacy。研究microhomology和in-frame mutation 发生率之间的关系将有助于设计高效的sgRNA。

       在本研究工作中，研究者通过计算手段，整合多细胞系的基因敲除后的高通量测序数据，基于可靠的统计检验，系统研究了多细胞系下CRISPR/Cas9系统基因敲除过程中microhomology和in-frame mutation发生率之间的关系，澄清了前人工作中关于microhomology pattern和in-frame mutation occurrence密切相关的结论（Kim J.S. et al, Nature Methods, 2015），并且进行了实验验证。研究者认为从目前的细胞系数据看，microhomology和in-frame mutation occurrence之间没有统计上显著的关联性，microhomology可能不是一个关联sgRNA cleavage efficacy的有效特征。同时研究者开发了一套基于高通量测序数据挖掘的sgRNA设计平台CAGE (https://github.com/bm2-lab/cage), 方便实验科学家进一步挖掘其他影响sgRNA cleavage efficacy的生物学特征。

        同济大学生命科学与技术学院的刘琦教授和温州医科大学眼视光重点实验室的谷峰教授为本文的共同通讯作者。生命科学与技术学院的直博二年级学生啜国辉为本文的第一作者，本项目得到了国家自然科学基金和上海市科委的资助。本论文发表后，被选为《Molecular Therapy-Nucleic Acids》当期的Featured Articles.

原文检索：

Deciphering relationship between microhomology and in-frame mutation occurrence in human CRISPR-based gene knockout

CRISPR-based gene editing is widely implemented in various cell types and has great potential for molecular therapy.1 The CRISPR-Cas9 system creates sequence-specific double-strand DNA breaks that are repaired by a dominant error-prone nonhomologous end-joining (NHEJ) pathway, often resulting in gene inactivation by generating frameshift alleles.1,2,3,4,5,6,7 CRISPR-based gene knockout (KO) often produces in-frame variants that retain functionality, however, which reduces KO efficiency. Recently, Sangsu Bae et al pioneered studies to use microhomology prediction to improve CRISPR-based KO efficiency in cell lines, by in-silico selection of target sites to reduce in-frame mutations.2 They presented that the preference of the in-frame mutations at a given target site can be predicted by the microhomology profile, and an alternative NHEJ pathway, i.e., the microhomology-mediated end joining (MMEJ) occurs.2,3 A score was defined to predict the microhomology-based out-of-frame mutation preferences.