Cas9 vs. NgAgo，基因编辑蛋白哪家强？[心得点评]

如今，生物学家又多了一种基因编辑蛋白的选择 – 来自格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）的Argonaute蛋白，简称NgAgo。不过，问题来了：NgAgo是否能取代CRISPR？这当然不会在一夜之间发生，不过也许有几个理由让你选择NgAgo，而不是Cas9或Cpf1。

背景：Argonaute和NgAgo

在真核生物中，Argonaute蛋白在RNA干扰中发挥重要作用，与向导RNA结合切割外源RNA。Argonaute蛋白也存在于原核生物中，一些蛋白抵御入侵的DNA。2014年，Swarts等人从嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）中鉴定出Argonaute（TtAgo），表明此蛋白能在磷酸化DNA的指导下，在体外切割DNA。不幸的是，Swarts等人未能在哺乳动物细胞中实现TtAgo介导的切割，这可能是由于温度要求高。

为了解决这个问题，河北科技大学韩春雨教授领导的研究小组搜索了Argonaute的同源蛋白。他们鉴定出NgAgo，并发现它能够切割多个哺乳动物细胞系中的质粒和基因组DNA，其效率与Cas9相似。与Cas9一样，当模板存在时，NgAgo还能够介导同源定向修复。（延伸阅读：河北科技大学Nature子刊：替代Cas9的基因组编辑新技术）

Cas9 vs. NgAgo

与Cas9相比，NgAgo有一些独特的功能。这些包括：

更高的靶向灵活性：与Cas9及其他CRISPR酶不同，NgAgo不需要PAM序列，因此用户在选择基因组目标上有着更高的灵活性。在富含GC的区域上，NgAgo的表现似乎比Cas9更为出色。

采用DNA向导：NgAgo采用5’磷酸化的DNA向导（称为gDNA），而不是Cas9或Cpf1所采用的RNA向导。这些24个碱基的DNA向导可能更加好用，因为可作为寡核苷酸订购，在细胞中保持稳定。gDNA也需要转染到感兴趣的细胞中。相比之下，RNA向导必须通过质粒表达或体外转录，而gRNA二级结构的改变可能影响编辑效率。研究人员在检验NgAgo是否偏爱某些向导序列时，以10个基因为对象，每个采用5条向导，没有发现切割效率有差异。如果这个结果可以在更大的研究中重复，那么这相对Cas9很有优势。

体积更小：NgAgo的长度只有887个氨基酸，比其他基因编辑蛋白更短，如SpCas9（1368 个氨基酸）、SaCas9（1053个氨基酸）或Cpf1（1228或1307个氨基酸）。当你使用容量小的病毒载体（如AAV）时，这一点很有优势。

碱基去除：以RNA为向导的CRISPR酶引起双链断裂，带来平端（Cas9）或交错（Cpf1）切割。NgAgo采用不同的方法，从gDNA指定的切割位点上随机去除1-20个核苷酸。这可能有利，也可能不利，具体取决于你的应用。在天然状况下，人们推测这种碱基去除能防止入侵的基因组再次恢复原样。如果你希望破坏基因功能，那么这种性质可能具有优势。不过，碱基切除后的修复可能改变目标序列，降低同源定向修复的效率。

脱靶效应：目前还需要更多的研究来比较CRISPR和NgAgo，不过NgAgo似乎有着更低的脱靶效应。在韩春雨教授的实验中，DNA向导中任一位置的单个错配都会影响NgAgo的活性，而三个错配则完全破坏活性。

向导忠诚度：NgAgo的向导掺入似乎仅限于蛋白合成的时期，因此NgAgo只对它的向导DNA忠诚，不能转换向导。尽管这种保真性可防止其他细胞核DNA与NgAgo结合，但似乎很难让NgAgo破坏多个目标。

在人们为这一研究成果喝彩的同时，也有人认为，大家不能高兴得太早。在Addgene的博文下面，有人评论道：“是否有人担心gDNA会随机掺入待修饰细胞的基因组中？” 的确，对于新的NgAgo，我们还有许多工作要做。（生物通 余亮）