CRISPR：让寨卡病毒无所遁形

　　

■记者 袁一雪

近日，一种快速检测寨卡病毒的试纸诞生，它的出现或许能够降低小头症婴儿的出生率。这种神奇的方法来自CRISPR技术。这个自2013年以来风靡世界的基因编辑技术正在生物医学研究领域引起一场巨变。

寨卡病毒肆虐全球，为了对抗它，科学家一边积极寻找预防的方法，一边也在开发快速检测的方法。近日，一个由美国哈佛大学维斯生物启发工程研究所合成生物学家James Collins博士领导的国际合作小组开发出一种低成本的基于试纸的快速诊断系统，该系统能够毒株特异性地检测寨卡病毒，而且它可能很快被用来在现场筛查血液、尿液或唾液样品。相关研究结果于2016年5月6日在线发表在Cell期刊上。

这种试纸的灵感诞生自2014年埃博拉病毒暴发期间，James Collins团队发现埃博拉病毒可以被一种特异性RNA标记。之后，他们又发现这种特异性RNA不仅能够标记埃博拉病毒的遗传特征序列，而且能够标记包括寨卡病毒、SARS冠状病毒、麻疹病毒、流感病毒、丙肝病毒和西尼罗河病毒在内的其他RNA病毒的遗传特征序列。研究人员认为，这种方法有朝一日能够用于在现场鉴定血液、尿液或唾液样品中的病毒。

这种神奇的方法就是CRISPR/Cas9技术。为了让新的试纸可以有效地检测在血液、尿液和唾液中存在的极低浓度的病毒，Collins团队设计一种简单的模块化工作流程，由扩增、寨卡病毒检测和CRISPR/Cas9辅助的毒株鉴别三个步骤组成。

作为一种源自细菌免疫系统的基因编辑机制，CRISPR/Cas9系统可以识别寨卡病毒基因组中特异的核酸序列。“寨卡病毒是一种RNA病毒，该方法通过RNA的体外反转录和扩增得到相同序列的DNA，这些DNA便可以被CRISPR系统识别。”中国科学院生物物理研究所研究员刘光慧在接受《中国科学报》记者采访时解释说。

CRISPR是何方神圣？

CRISPR是“规律成簇间隔短回文重复”的英文缩写，来自细菌体内，肩负着细菌免疫的“重任”。它驱逐外来DNA的过程并不复杂。首先，CRISPR把病毒DNA的片段整合进细菌自己的基因组，然后转录出RNA。之后，CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并利用细菌表达CRISPR相关核酸酶，也就是Cas酶，切割病毒的DNA，阻止病毒完成其功能。在完成了对外来病毒快速精确打击后，细菌还可以将整合过的基因组的序列传递给下一代细菌，就像人类的遗传系统，让下一代免受相同病毒的骚扰。

其中，Cas酶起到了至关重要的作用，为了更好地利用这一技术工具，不少实验室解析了这种酶的精确分子机制，探索其如何靶向作用于DNA的。2014年，来自美国伦斯伯克利国家实验室和加州大学伯克利分校的研究人员，解析了这一叫作Cas9的细菌酶在病毒感染过程中是如何在RNA序列的引导下识别和降解外源DNA，并且实现了在动物和植物细胞中的靶向遗传修饰。通过结合单分子成像和大量的生化试验，该研究小组证实Cas9的基因组编辑能力是通过称作为“PAM”的短DNA序列来实现的。

南方医科大学公共卫生与热带医学学院副院长、教授陈晓光在接受《中国科学报》记者采访时表示，CRISPR/CAS9是2013年以来风靡世界的基因编辑技术，但将该技术应用于病原体的检测，则才见于2016年5月6日在线发表在Cell期刊上Collins等的研究报道，“因此CRISPR检测方法是一种全新的、划时代的病原检测新技术，将对病原检测/传染病诊断带来革命性的影响”。

下一个诺贝尔奖？

从1953年沃森和克里克发现DNA双螺旋结构到2000年人类基因组计划完成，人类一直处于对基因组的了解和认知阶段，而CRISPR技术的快速发展和广泛普及实现了从认识基因组到主动操控基因组的时代跨越。

可以说，CRISPR的发现将为人类提供了认识和实现病毒免疫的捷径，而且它正在生物医学研究领域引起一场巨变。因为，相比较其他基因编辑手段，CRISPR使用起来廉价、迅速且简单。早期实验室发现的“锌指核酸酶”需要花费5000多美元才能订购到，而且它们很难进行基因改造。但是CRISPR却大不相同：它依靠一种利用引导性RNA分子将其导向目标DNA，随后被称为Cas9的酶对目标DNA进行切割，从而实现目标基因序列的缺失或插入想要的序列。通常，研究人员需要订购的只是RNA片段，全部花费只有30美元。

“CRISPR系统的优势在于其操作简便、低价高效。CRISPR系统的出现大大降低了基因组编辑的技术门槛，为动植物的精准基因操作提供了强有力的技术支持，使得科研界全面进入高速高质高量的基因编辑时代。同时，为开发基于基因编辑的人类疾病治疗手段提供了无限可能性。”刘光慧总结道。

这让CRISPR很快席卷全球实验室。研究人员希望利用它调整人类基因以消除疾病，创造生命力更加顽强的植物，并且消灭病原体。

去年，伦敦帝国学院的研究团队通过基因编辑使疟蚊丧失生育能力，并将这一性状传播到群体中。这项发表的研究论文提到，冈比亚按蚊是撒哈拉以南非洲危险疟原虫的主要携带者。研究人员对冈比亚按蚊进行了遗传改造，让它们携带了一种破坏雌蚊子卵子生成的改造基因。基因驱动让这个基因加速传递给蚊子后代，进而传播至整个种群。

应用前景亟待开发

既然CRISPR可以检测出寨卡病毒，那么是否可以同理应用到其他病毒呢？“目前Collins等发明的检测体系主要针对寨卡病毒，但稍加调整该体系理论上可以用于几乎所有的RNA病毒，若进一步与韩春雨等的发明相结合，还可能用于DNA病毒的检测。因此，该检测体系的应用前景非常广阔！”陈晓光认为。

不过，刘光慧进一步指出：“虽然理论上CRISPR检测寨卡病毒的方式能够被复制到其他病毒的检验中，但关键是能否从待测病毒基因组中找到专属特异的核酸序列，从而最大可能地排除非特异识别导致的假阳性。”而且，目前Collins研究中所用的病例标本只是一例感染寨卡病毒的猴，真正要从实验室走向实际应用，还需要大量的实际样本来检验。“毕竟，实验室研究与临床和现场的检测还有许多的不同。”陈晓光补充道，“还需要解决的尚有CRISPR/CAS9技术常见的‘脱靶’效应，如果这个问题得不到妥善解决，应用到人体CRISPR/CAS9就可能在RNA/DNA上乱‘切’，从而造成许多意想不到的‘副作用’。”

虽然还有很长的路要走，但这更激发了人类对于CRISPR的研究热情。今年2月，加州大学昆虫学专家也曾在Nature Review Genetics杂志上发表技术综述中提到，近年来，突飞猛进的基因组编辑技术，特别是CRISPR技术，大大推动了基因驱动的发展速度。基因驱动与CRISPR等工具的结合，可以帮助人们通过经济环保的方式减少或消灭蚊媒疾病，去除外来的入侵物种，逆转生物的杀虫剂和除草剂抗性。

除此之外，“迅猛发展的CRISPR系统，将会为未来的临床应用提供有力的技术手段，如利用CRISPR系统构建疾病模型用于靶向药物的筛选，以及利用该系统对单基因突变所致的遗传病进行突变基因靶向矫正的基因治疗等。”刘光慧提到。

《中国科学报》 (2016-05-20 第4版 新知)