单细胞研究指南：RNA-seq方法比较

多细胞生物的每个细胞都携带着相同的遗传学信息。不过，近年来蓬勃发展的单细胞研究告诉我们，每一个细胞都是独一无二的。The Scientist杂志最近联系了单细胞研究领域的一些专家，请他们分享了在单细胞中进行转录研究的秘诀。希望帮助研究者们更好地构建文库，处理和分析结果数据。

生物通报道：多细胞生物的每个细胞都携带着相同的遗传学信息。不过，近年来蓬勃发展的单细胞研究告诉我们，每一个细胞都是独一无二的。不同类型的细胞激活特定组合的机制，即使是同类型细胞，基因表达也会出现差异。

那么，细胞之间的哪些差异有生物学意义，哪些差异来自于技术偏好呢？要获得可靠的结果又需要研究多少细胞呢？这些问题曾经是单细胞研究（尤其是单细胞转录组研究）的拦路虎，令人望而却步。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞数据分析工具在这方面为人们提供了很大的帮助。

The Scientist杂志最近联系了单细胞研究领域的一些专家，请他们分享了在单细胞中进行转录研究的秘诀。希望帮助研究者们更好地构建文库，处理和分析结果数据。

上接：单细胞研究指南：测序方法大比拼

DROP-seq和inDROP

哈佛医学院的研究人员开发了以微滴为基础的两种独立技术Drop-seq和inDrop。他们利用微流体装置将带有条码的微珠和细胞一起装入微小的液滴，建立了快速、廉价、高通量的单细胞RNA-seq方法。这两种技术将细胞隔离在微小的液滴中，装上用于扩增的条码引物，由此检测数以千计的细胞。研究者们认为，Drop-seq和inDrop能够帮助生物学家进一步发现和分类人体细胞，绘制大脑等复杂组织的细胞多样性图谱，更好地了解干细胞分化，获得更多疾病的遗传学信息。（更多信息请参见：两篇Cell文章：廉价的单细胞基因表达分析新技术）

Enard及其同事发现，Drop-seq在单个细胞中检测的基因数还不到Smart-seq/C1、CEL-seq和SCRB-seq的一半。不过，在统计学水平上研究差异性表达的时候，高通量Drop-seq和SCRB-seq是最划算的。哈佛医学院Steve McCarroll实验室去年下半年根据用户反馈，在自己网站上公布了3.1版的Drop-seq（mccarrolllab.com/dropseq）。

参与开发SCRB-seq的Stefan Semrau正在搭建自己的Drop-seq平台。Semrau从Whitehead生物医学研究所搬到Leiden物理研究所的时候，发现自己用FACS已经不那么方便了，于是他为新实验室选择了Drop-seq。建立微流体芯片和液滴系统是整个过程中最艰难的部分，不过Semrau实验室的一名微流体博士后仅用三周就搞定了这些问题。Drop-seq文库制备是任何分子生物学研究者都熟悉的标准操作。据Semrau估计，搭建和优化Drop-seq大概只需要六个月时间。

四种单细胞RNA-seq方法比较

自二十世纪九十年代中期以来，芯片就一直是基因组表达分析的中坚力量。在这一技术最辉煌的时期，准备研究基因表达模式的人都会想到使用芯片。不过随着测序成本的直线下降，RNA测序（RNA-seq）成为了越来越受欢迎的转录组分析方法。2015年6月，The Scientist杂志与多位专家共同探讨了从芯片到RNA-seq的过渡，希望帮助研究者们顺利度过这段艰难的转型期，最终实现华丽转身。（更多详细信息参见：从芯片到RNA-seq的转型之路）

在生物学中，位置信息是很重要的。mRNA是活跃基因的功能性拷贝，它们在活组织中的定位，往往与细胞和组织的生长发育调控有关。以往人们要磨碎细胞才能同时分析多个mRNA，但这样就无法了解mRNA在细胞中的定位。哈佛医学院Wyss研究所的科学家们解决了这个问题。 George M Church和Je Hyuk Lee领导团队开发了荧光原位RNA测序（FISSEQ）技术，该技术可以在固定的细胞和组织中，获得全基因组范围的基因表达图谱。（更多详细信息参见：遗传学大牛教你荧光原位RNA测序）