快速构建多重sgRNA载体利用CRISPR/Cas9技术高效敲除基因

　　

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《遗传》杂志精选内容：

IAA2（Indole Acetic Acid 2）是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员，目前还没有对其突变体的报道，阻碍了对其功能和作用机制的深入研究。

在CRISPR/Cas9基因组编辑技术中，一个sgRNA只能靶向基因的一个位点，有时基因敲除的效率并不高。为了提高敲除效率，来自浙江大学生命科学学院的研究人员在Golden-Gate克隆技术的基础上，研发了一种新方法，与其他构建多重sgRNA载体的方法相比，这一方法具有快速、高效等优点，同时研究得到的5个突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料。

CRISPR/Cas 是细菌和古生菌抵抗病毒或外源质粒入侵的获得性免疫系统，主要有 3种类型：I 型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅱ型系统被广泛应用于基因组编辑技术。嗜热性链球菌(Streptococcus thermophilus) 具 有 典 型 的 Ⅱ 型 CRISPR/Cas 系 统 ， 该 系 统 编 码tracrRNA(Trans-activating crRNA)，能指导 RNaseⅢ和 Cas9 完成前体 crRNA 的成熟；随后，tracrRNA 与成熟的 crRNA 的互补序列配对形成 RNA 二聚体，作为向导 RNA(Guide RNA,gRNA) ，引导 Cas9 蛋白识别和降解入侵的外源 DNA。通过人工设计，研究者将tracrRNA/crRNA 二聚体改造成单一向导 RNA(Single guide RNA， sgRNA)，极大方便了基因组编辑技术的研究。

Cas9 蛋白是一种核酸内切酶，含有两个核酸酶结构域：RuvC-like 结构域和 HNH 核酸酶结构域。HNH 结构域切割与 crRNA 互补的模板 DNA 链，切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif, PAM)上游 3nt 处；而 RuvC-like 结构域对另一条 DNA 链进行切割，切割位点位于 PAM 上游 3~8nt 处。在基因组编技术中， sgRNA 指导 Cas9 蛋白在目的基因的 PAM(保守碱基序列为 NGG)上游切割，产生 DNA 双链断裂(Double strands break, DSB)。DSB 产生以后，细胞主要通过两种方式进行修复：同源重组(Homologous recombination, HR)和非同源末端连接(Nonhomologous end joining, NHEJ)。多细胞真核生物主要通过 NHEJ 的方式修复 DSB。由于 NHEJ 只是将断裂的 DNA 片段进行简单的加工之后连接起来，常常会在断裂位点产生碱基的缺失或插入，造成基因突变。

1 个 sgRNA 只能靶向基因的 1 个位点，有时基因突变的效率并不高，这是因为预测sgRNA 效率的体系和方法还不是很完善。多个 sgRNA 能靶向同一基因的不同位点，提高基因突变的频率；也能造成较大片段的缺失突变，适用于 miRNA 基因的基因组编辑和某些疾病模型的建立。另外，多个 sgRNA 也能靶向不同的基因，特别是同一信号通路、同一代谢途径或同一基因家族的基因，在基础生命科学研究中具有重要的应用价值。

在这项研究中，研究人员在Golden-Gate克隆技术的基础上，通过两轮PCR反应，将每3个sgRNA串联到同一个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应，获得最终的表达载体。

结果表明，设计的6个sgRNA有4个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变。与单个sgRNA相比，多重sgRNA的基因敲除效率高、种系突变多；与其他构建多重sgRNA载体的方法相比，这一方法也具有快速、高效等优点。同时所得到的5个突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料。

作者指出，在基因组编辑实验的载体构建中，研究者大多采用 Golden-gate 克隆技术或连接酶非依赖的克隆(Ligation-independent cloning, LIC)技术。 Golden-gate 克隆技术的具体步骤可以有所变化，这项研究采用了两轮 PCR 法，而文献中往往用两轮克隆法。结果表明，两轮 PCR 法与传统的两轮克隆法相比，既节省了感受态细胞又节省了时间，而且少使用一种 IIs 型核酸内切酶，不需要 3 个第一阶段的克隆载体。因此两轮 PCR 法具有快速、高效等优点。同时，由于使用了高保真酶， PCR 片段都不长， 并且最终的表达框是测序验证的，因此，两轮 PCR 扩增中可能产生突变的这个潜在缺点是可以避免的。

另外，如果只构建一种表达载体，可以在表达载体上设计 Golden-gate 位点，直接将两轮 PCR 产物与表达载体进行连接反应，快速获得最终的载体。但如果要构建多种表达载体，如不同启动子驱动的 Cas9 载体，或不同抗生素筛选标记的载体等，用 Gateway 的思路，先构建入门载体再进行 LR 反应，是更加高效的。

研究人员在前期研究中只构建了含单个 sgRNA 的载体，结果突变效率总体不高，不同的基因突变效率不一，在 IAA2 基因上没有得到突变体。本文用两轮 PCR 法构建了 2 个三重串联的 sgRNA 载体，最终结果表明，所设计的 6 个 sgRNA 有 4 个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变。与单个 sgRNA 相比， 多重 sgRNA 的基因敲除效率高、种系突变多；与其他构建多重 sgRNA 载体的方法相比，这一方法具有快速、高效等优点。实验中得到 5 种可遗传的突变体为后续的 IAA2 功能研究提供了良好的材料。

目前，CRISPR/Cas9 技术在基因组编辑中的应用越来越广泛，为人们定点改造动植物甚至人类基因组提供了可能。串联多个 sgRNA 表达框是进一步提高 CRISPR/Cas9技术效率的重要途径。另外，目前已经出现了一些靶位点设计和活性检测的方法，科学选择靶位点也能增强 sgRNA 的稳定性和活性，提高 CRISPR/Cas9 技术的基因组编辑效率。

原文检索：

刘丁源 邱婷 丁晓辉 李苗苗 朱睦元 王君晖. 快速构建多重sgRNA载体利用CRISPR/Cas9技术高效敲除拟南芥IAA2基因[J]. 遗传, 0, (): 0-0.
Muyuan Zhu. Rapid construction of multiple sgRNA vectors and high efficient knockout of Arabidopsis IAA2 gene using the CRISPR/Cas9 genomic editing technology. HEREDITAS(Beijing), 0, (): 0-0.