运用CRISPR技术构建CTCF蛋白降解细胞系

　　

生物通“核心刊物”栏目创办于2002年，主旨在于向国内专业人士展示科研核心刊物，以及生命科学领域杂志每期重点内容，为读者呈现精彩纷呈的国内科研动向，和重大科研进展。目前包括《遗传》、《中国生物工程杂志》、《科学通报》等重点期刊，也欢迎生物类期刊联系合作（联系邮箱：[e-mail]）。

生物通报道：CTCF是脊椎动物关键的绝缘子蛋白，在细胞生命过程中发挥重要作用，敲除CTCF基因会导致小鼠胚胎死亡。为进一步探讨CTCF的功能，来自军事医学科学院的研究人员利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，将 MD 插入到进基因组 CTCF 表达框上游，以期周期性持续降解细胞内 CTCF 蛋白，从而获得 CTCF 蛋白特异性降解细胞系，为后续研究 CTCF 功能奠定了基础。

CCCTC 结合因子(CCCTC binding factor，CTCF)是一种在进化上高度保守的锌指蛋白，其功能广泛，可以在转录激活、转录抑制，绝缘子、基因印迹和 X 染色体失活等过程中发挥功能。 CTCF 蛋白在脊椎动物基因组有上万个结合位点，这些结合位点既有组成型的， 也有组织类型特异性的。高通量测序结果证实，CTCF 在基因组关键调控区域如染色质结构域边界、增强子和启动子等位置富集。作为基因组高级结构的关键组织者， CTCF 调控细胞核内全局的染色质高级构象，在 DNA 甲基化、染色质高级结构和种系特异的基因表达调控等诸多方面发挥着重要的表观遗传调控作用。

为了深入研究基因功能，研究人员利用 RNA 干扰（RNA interference, RNAi）、锁核苷酸(Locked nucleic acid,LNA)封闭等方法在转录、翻译等不同层次调节其蛋白表达水平并取得一定进展。然而，与转录、翻译层次的调控相比，翻译后蛋白水平的直接调控具有更加直接、高效、可逆等特点。细胞周期蛋白 B 含有有丝分裂期特异性降解结构域（Mitosis-specific degradation motif，MD），当细胞进入有丝分裂中期后，MD 激活泛素介导的蛋白降解途径，迅速降解周期蛋白 B。将 MD 与特定目的蛋白融合，即可实现特定蛋白的高效降解。

早期由于进行基因组编辑比较困难，人们通常将 MD 与目的基因整合至染色体外表达载体，再将该载体转染相应细胞进行外源表达，而这种方式无法影响内源蛋白表达水平，对目的蛋白总体表达水平的影响也有限。 CRISPR/Cas9 技术的出现使得在基因组上进行直接改造变得简便易行。

因此，在这篇文章中，研究人员利用CRISPR技术，在内源性CTCF表达框上游敲入一个有丝分裂期降解结构域(Mitosis-special degradation domain, MD)，该结构域可以带动CTCF融合蛋白在M期降解。作为对照，将MD结构域的第42位的精氨酸突变为丙氨酸，形成无降解活性的MD*，可使MD*-CTCF融合蛋白始终稳定存在。将嘌呤霉素与融合蛋白同时表达，即可利用抗生素筛选，高效地筛选到纯合克隆。

同时研究人员利用蛋白印迹技术和免疫荧光检测3种细胞在不同细胞周期的CTCF蛋白变化情况，发现MD-CTCF细胞系CTCF蛋白含量约为野生型细胞的10%，MD*-CTCF细胞系的CTCF含量与野生型没有显著差别；通过流式细胞术观测降解CTCF对细胞的影响，发现MD-CTCF细胞系G1期明显延长。总之，利用CRISPR/Cas9技术在CTCF表达框上游高效地插入MD，首个CTCF特异性降解的人类细胞系获得成功构建。

这项研究成功构建了 CTCF 特异性降解的细胞系（MD-CTCF）。结果发现与野生型 A549 细胞相比，CTCF 在 MD-CTCF 细胞系的整个细胞周期都显著降低但细胞仍能存活，这可能是与正常细胞相比， A549 细胞基因组高度紊乱，对 CTCF 依赖程度降低。因此，当细胞从 M 期进入 G1 期后，虽然 CTCF 含量极低，但细胞也能勉强生长。

长期以来高等生物基因组原位基因敲入存在效率低的难题。CRISPR 技术借助 gRNA 精确引导和 Cas9 高效切割，精确地在基因组上产生切口，从而极大增加了基因组切割的效率。但由于同源重组本身效率不高，因此获得基因敲入阳性克隆的概率仍在 0.01‰以下。在相应供体片段中加入抗性标记，通过抗生素筛选，则可有效富集阳性克隆，提高筛选效率。但是，利用单一抗生素筛选可能获得大量单拷贝杂合克隆。有报道指出在供体片段中加入不同抗性基因，如杀稻瘟素与嘌呤霉素联用可以提高获得双拷贝纯合克隆的效率。然而这种设计需要采用多个供体质粒，且最后只能筛选获得在等位基因座位上恰好是不同抗性的供体的克隆，增加了操作难度，且进一步降低了克隆得率。有研究表明在带有抗药基因的双顺反子报告系统中，增加抗生素使用浓度可以杀死抗性基因表达水平较低的克隆。

这项研究发现，双拷贝克隆对嘌呤霉素的耐受性（6 μg/mL）显著高于单拷贝克隆（2 μg/mL）。嘌呤霉素浓度达到 4 μg/mL 即可有效杀死大部分单拷贝克隆，显著提高了获得纯合阳性克隆的概率，为 CRISPR/Cas9 介导的原位框内融合的双拷贝克隆筛选提供了一种有效途径。

CRISPR/Cas9 系统存在一定的脱靶风险。一般认为前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)的类型，sgRNA 与靶序列结合的特异性以及不同的细胞类型都有可能影响到CRISPR/Cas9 系统的脱靶效概率。

为降低脱靶的风险，除提高 sgRNA 的特异性外，还可对Cas9 蛋白进行改造。主要策略有突变 Cas9 的一个具有酶切活性的结构域，只保留一个有活性的结构域，利用两个配对的 Cas9 蛋白进行酶切的双切口酶策略以及融合一个 Fok I 核酸酶形成的 fCas9 策略，这两种策略因均要识别两个 DNA 位点，所以可以有效地降低脱靶的风险。

这一研究采用抗生素筛选的策略，当供体片段正确插入到启动子下游时才会启动基因的转录和翻译。而一旦存在脱靶，插入片段插入到其他的基因座位，puro 抗性基因无法表达，克隆因此无法在含有嘌呤霉素的培养基中存活，从而在一定程度上降低了获得脱靶克隆的风险。

CTCF 在维持和重建细胞染色体构象及调控基因表达中发挥重要作用。在拓扑学相关结构域的边界具有众多的 CTCF 结合位点， CTCF 结合在这些位点介导远距离染色质互作。 Mundlos等利用 CRISPR/Cas9 系统敲除 WNT6/IHH/ EPHA4/PAX3 的基因座位的边界，导致了拓扑学相关结构域的改变，并最终证实短指（Brachydactyly）、并指（F-syndrome）和多指（Polydactyly）是由于基因座位的改变导致染色质构象崩解最终影响到基因的表达而引起的；上海交通大学吴强课题组通过 CRISPR 技术改变 CTCF 的结合位点的方向，发现相关位点染色质构象发生改变，并进而影响到启动子和增强子的功能，直接证实了 CTCF 的结合位点的定位对染色体互作的影响。

对于 CTCF 降解会如何影响染色质构象人们还知之甚少。MD-CTCF 细胞系的建立为研究CTCF 蛋白在降解条件下染色质三维构象的变化，阐明染色质构象形成的机制奠定了基础。

（生物通）

系列文章：

基于CRISPR-Cas9系统高通量筛选研究功能基因

CRISPR/Cas9技术及其在转基因动物中的应用

CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在HIV-1感染治疗中的应用进展

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在癌症研究中的应用

原文检索：

谢德健 师明磊 张彦 王天艺 沈文龙 叶丙雨 李平 何超 张香媛 赵志虎. 运用CRISPR技术构建CTCF蛋白降解细胞系[J]. 遗传.
SHI Ming-Lei Zhi-Hu ZHAO. Construction of CTCF degradation cell line by CRISPR/Cas9 mediated genome editing. HEREDITAS(Beijing).