中国农科院Nature子刊CRISPR新成果

4月1日，Nature旗下子刊《Scientific Reports》在线发表了中国农科院作物科学研究所与安徽农业大学的一项研究成果。在这项研究中，研究人员在稳定转化的植物中，成功地制备了一种基因/替换系统，可将感兴趣的基因用于目标作物的遗传改良。

　　

生物通报道：精确的DNA/基因替换，是一种很有前景的基因组编辑工具，很容易推广到分子工程和设计育种。目前，CRISPR/Cas9系统能够很好地作为一种工具用于植物基因敲除，例如：中国农科院用CRISPR实现大豆基因组编辑；安徽农科院用CRISPR编辑水稻基因；基因组编辑技术在植物基因功能鉴定及作物育种中的应用。然而，植物中的基因替换却很少有报道。

4月1日，Nature旗下子刊《Scientific Reports》在线发表了中国农科院作物科学研究所与安徽农业大学的一项研究成果，题为“An alternative strategy for targeted gene replacement in plants using a dual-sgRNA/Cas9 design”。在这项研究中，研究人员在稳定转化的植物中，成功地制备了一种基因/替换系统，可将感兴趣的基因用于目标作物的遗传改良。本文通讯作者是中国农科院作物科学研究所的谢传晓博士，作物科学研究所的徐云碧研究员、毛龙研究员也是本文共同作者。

用于精确的靶向基因组编辑的简单方法，可能在植物的基因功能鉴定和遗传改良方面有着重要的应用价值。近年来，大范围核酸酶1、锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)，已被开发作为序列特异性核酸酶，用于将靶向双链断裂（DSBs）导入DNA，以让我们通过内源性的DNA损伤修复途径，进行基因编辑。

最近，有研究人员基于CRISPR相关核酸酶系统，开发出一种新的RNA引导性基因编辑工具。CRISPR/Cas9核酸酶系统，可以用一个嵌合RNA（一个所谓的单导向RNA，sgRNA）靶定特定的基因组位点，与蛋白质引导的靶向工具相比，具有更高程度的靶向选择灵活性。CRISPR/Cas9系统已被证实能促进不同物种的基因组编辑，包括哺乳动物(包括人类)、微生物和植物。

使用CRISPR/Cas9实现的基因敲除，代表着这个系统的最早应用，因为由Cas9诱导的DSBs，可通过一种非同源末端连接(NHEJ)机制而得以修复，这是一种容易出错的修复途径，可能会在DNA修复过程中引入短的缺失或插入。HDR(homology-directed修复)，是修复染色体中DSBs的一种替换方法，对于植物基因组工程更有吸引力，因为它可以实现更微妙的DNA序列修改，包括DNA修正、靶向基因敲入或更换，或任何类型的突变。

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HDR依赖性靶基因置换或敲入，为基因组编辑提供了一个前所未有的机遇，但也更有挑战性，因为靶向DSB(s) 必须和一个修复模板共存。可以通过使用一对TALENs或sgRNAs与Cas9核酸酶，产生靶向的基因组缺失突变。诱导的双重DSB损伤或缺失突变，也是靶向基因替换的一个必备步骤。

据报道，在一种体外系统中，CRISPR/Cas9可在烟草(N . benthamiana)原生质体中成功实现HDR介导的基因替换。也有研究在玉米中利用CRISPR/Cas9，通过HDR，将一个特征基因插入到一个靶向的DSB损伤部位，并用Cas9和sgRNA表达组件共同“轰击”DNA供体修复模板，以确保有足够的供体拷贝出现在靶细胞中。粒子轰击策略的优点在于，可以提供许多供体模板的副本。然而，应该在后续步骤中处理目标生物中的转换拷贝，来自载体的一部分DNA序列，可能是接收者基因组的污染物。

CRISPR/Cas9的稳定变换，和一个包含基因组编辑必要元素的载体（通过农杆菌介导的转化），可以通过识别“非转基因”生物很容易地筛选出来。关于HDR介导的基因打靶，Fauser等人证明，核酸酶和切口酶系统都是有效的工具。当配对部位互相靠近时，精确设计相邻配对的sgRNA/Cas9切口酶——这可能有增强特异性的优点，可被用于靶定基因插入、基因堆叠和基因敲入。然而，迄今为止，还没有研究在植物中创建体内靶向基因替换事件，同时具有较低的转基因污染风险。

在这项研究中，研究人员通过一对sgRNAs的同时传递，来靶定两个MIRs（AtMIR169a和AtMIR827a）的两个侧翼区。他们首先设计了一个双重sgRNA/Cas9载体组合(construct# 1)，成功地删除了miRNA基因区域——MIR169a和MIR827a。通过PCR和随后的测序，研究人员验证了这些缺失，从而在MIR169a和MIR827a位点分别产生了20%和24%的删除效率。

然后，他们通过CRSPR/Cas9和一个DNA修复供体模板的稳定转换，实现了一个目的基因的靶向替换，其中相同的sgRNA靶位点被设计为删除植物靶基因，并删除促进HDR的DNA供体。这些研究结果展示了一种替代策略，使用CRSPR/Cas9系统，通过基因替换进行基因组编辑。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
An alternative strategy for targeted gene replacement in plants using a dual-sgRNA/Cas9 design
Abstract: Precision DNA/gene replacement is a promising genome-editing tool that is highly desirable for molecular engineering and breeding by design. Although the CRISPR/Cas9 system works well as a tool for gene knockout in plants, gene replacement has rarely been reported. Towards this end, we first designed a combinatory dual-sgRNA/Cas9 vector (construct #1) that successfully deleted miRNA gene regions (MIR169a and MIR827a). The deletions were confirmed by PCR and subsequent sequencing, yielding deletion efficiencies of 20% and 24% on MIR169a and MIR827a loci, respectively. We designed a second structure (construct #2) that contains sites homologous to Arabidopsis TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) for homology-directed repair (HDR) with regions corresponding to the two sgRNAs on the modified construct #1. The two constructs were co-transformed into Arabidopsis plants to provide both targeted deletion and donor repair for targeted gene replacement by HDR. Four of 500 stably transformed T0 transgenic plants (0.8%) contained replaced fragments. The presence of the expected recombination sites was further confirmed by sequencing. Therefore, we successfully established a gene deletion/replacement system in stably transformed plants that can potentially be utilized to introduce genes of interest for targeted crop improvement.