CRISPR女王：她的生命被CRISPR照亮

不管你是否相信，一项新技术确实可以改变科学家的人生：现年48岁的Emmanuelle Charpentier在其45岁之前还无法雇用自己的技术员，也没获得过长期资助，然而经过艰苦漫长的实验研究，她终于在基因编辑技术上爆发了，她的故事经历告诉了我们什么？CRISPR如何被拨开重重面纱显露出来？迄今为止最争议的技术专利之争？

　　

 

一位多年来埋头于实验室枯燥生活的微生物学家，突然有一天由于基因编辑技术站在了聚光灯下

   现年48岁的Emmanuelle Charpentier在过去二十年学术生涯中辗转去过了5个国家九所不同的研究院，“我总是不得不从零开始，亲自构建新的实验室，”她说。45岁之前Charpentier还无法雇用她自己的技术员，一般获得的也都是短期资助。然而在2012年这一切开始变得不同了，一种被称为CRISPR（规律成簇的间隔短回文重复）的基因编辑技术引发了热潮，Charpentier也成为了这种革新整个生物医学界技术的关键发明者。

   这一年，Charpentier赢得了十个著名的科学奖项，并且正式接手德国柏林马普研究院感染生物学研究所所长一职，同时她与其他学者共同创办的基因治疗公司：CRISPR Therapeutics 也成为了世界上融资最多的临床生物技术公司之一。去年9月，Charpentier的电话一直响个没完，世界各地的记者都希望能联系上她，因为不少人认为她也许能获得当年的诺贝尔奖。

   对于Charpentier来说，学术风头并不是她想要的，“法国哲学家Jean-Paul Sartre曾说过，‘得奖会让你禁锢在一个小圈子里’，我希望我能保持工作的状态，让自己的脚踏实的踩在地上，”她说。为此Charpentier一直在努力，本周（4月26）她的研究组还在Nature杂志上发表文章，提出了一种更简单更有效的CRISPR系统：CRISPR-Cpf1（新一代CRISPR系统）。

人生的意愿与轨迹

   Charpentier看上去又瘦又小，一双漆黑的眼睛让她显得很焦躁，她自小生活在巴黎附近的一个小镇上，从一开始对于自己想要什么她就有了一个清晰的概念——推动医学发展，这来自于居住在古老修道院的一位传教士嬷嬷，“这样你就能独自面对自己”。

   Charpentier的父母并不反对，虽然Charpentier也喜爱钢琴和芭蕾，但她最终还是进入到生命科学研究领域，在巴黎第六大学读完本科后，她决定就近在巴斯德研究所攻读博士学位，这是一所在基础研究和抗生素耐药性研究方面具有良好声誉的研究所。Charpentier的博士论文内容为基因组和细胞之间迁移的细菌DNA片段分析，这些片段涉及耐药性传递。

   “我当时的梦想是在巴斯德研究所领导一个实验室工作，而这需要博士后工作经历，”因此Charpentier开始准备，她向美国多家实验室投递了50多份求职信，最后选择了洛克菲勒大学Elaine Tuomanen实验室，进行肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的研究，这是一种造成肺炎、脑膜炎和败血症主要死因的病原体，具有一种特殊的可移动遗传元件，能在维持其病原性的前提下移动基因组。

   为了了解这种病原体如何控制这些元件的分子机制，Charpentier带着一丝惶恐来到了纽约，不断不断的努力工作，沉浸在实验中，之后她又进入了纽约大学医学院皮肤细胞生物学家Pamela Cowin的实验室，有机会接触到了小鼠功能性基因的工作原理。

 

   在这里，Charpentier很快发现操控转基因小鼠要比操纵细菌难得多，她花了两年时间完成了毛发生长调控研究。之后又搬回了欧洲，“我了解了细菌中每个生化途径是如何进行的，”当时小分子RNA在基因调控方面的功能研究风靡一时，许多研究项目都在向这方面倾斜，Charpentier也在产脓链球菌（Streptococcus pyogenes）中发现了调控一种重要毒性分子合成的RNA。

CRISPR与维也纳

   就是在维也纳，Charpentier第一次开始思考 CRISPR。在本世纪初，这还是一个冷僻研究领域，只有少数的微生物学家注意到了这种部分细菌中存在的抗病毒防御系统组成部分。细菌能拷贝一个侵入病毒的部分DNA，然后将其插入到基因组中，从而在病毒下次来犯时，认出它来，将其DNA切断。不同的CRISPR系统在这个袭击过程中具有不同的方式，但所有已知的系统都包含一个RNA分子，也就是CRISPR RNA。

   Charpentier希望能在S. pyogenes 基因组中找到调控RNAs的位点，为此她找到了分子微生物学家Jörg Vogel（曾研发出了一种大规模绘制基因组RNAs图谱的方法），后者同意完成S. pyogenes绘制图谱。

   在此基础上，Charpentier等人首先注意到了一种超富集小分子：trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)。“最初，我们发现了一种新的RNA：tracrRNA，与CRISPR-Cas9系统相关，相关研究结果我们于2011年发表在Nature杂志。”

   TracrRNA的序列和在基因组上的位置正是Charpentier生物信息学分析中，预测靠近CRISPR 位点的地方，因此他们意识到这个分子很可能参与了之前未曾被发现的 CRISPR 系统。Charpentier等人又开始了漫长的实验，希望能了解这个系统，最终他们发现CRISPR 系统包含了三个元件：tracrRNA, CRISPR RNA和 Cas9酶。

   这令他们感到十分惊讶：“其它CRISPR 系统只包含一个 RNA 和许多蛋白，没有发现这其中涉及两种RNAs，”Charpentier说。这一系统是如此的简单朴实，因此Charpentier断定未来有一天，它将会成为一种强大的基因工程工具。

   但CRISPR 系统究竟是如何工作的呢？

   Charpentier怀疑两个 RNA实际上可能相互作用，指引Cas9找到病毒中的一个特殊DNA序列。这个观点有些剑走偏锋，研究组主要进行的是蛋白研究，而不是RNAs研究，但是Charpentier“行事总是出乎人意料，她其实是一个非常反传统的人”，Tuomanen说。

   对于当时的情景，Charpentier回忆道，“我很难说服我的学生们来进行这个关键的实验，验证两个RNAs是否相互作用，但最终维也纳大学的一个学生Elitza Deltcheva自愿来帮忙。”

   在当时的CRISPR研究“小圈子”，Charpentier还是默默无闻的，2010年她带着自己的成果第一次参加了荷兰瓦赫宁根的CRISPR 会议，那时她刚刚将研究组成果投递给Nature。“她的出现成为了会议的一大亮点，这是一个美丽的故事，而且让人感到意外，”瓦赫宁根大学的微生物学家，也就是当时会议的组织者John van der Oost说。

   之后在2011年的美国微生物学会会议上，Charpentier遇到了加州大学伯克利分校的结构生物学家 Jennifer Doudna，Charpentier立刻就被她迷住了，“从第一眼看到她，我就喜欢上了她的干练。”

Jennifer Doudna（左）和Emmanuelle Charpentier（右）

   两位女科学家开始了合作，进入了CRISPR系统研发的第二个关键阶段——Cas9如何剪切DNA，随着其背后的秘密被解开，研究人员发现这一系统确实可以用于靶向基因组，修改序列，这一技术也开始像旋风一样，席卷了世界各地的各大实验室……

两个决定

   与此同时，Charpentier作出两项重要的决定。首先就是她最初的梦想——为推动医学做点什么，她联系了巴黎一家著名的医药公司赛诺菲Sanofi，尝试共同组建公司，探索人类疾病的基因治疗方法。就此 CRISPR Therapeutics 成立了。

   第二个决定是她搬到德国，成为了德国汉诺威医学院的一位教授，并最终进入了马普研究院，专心致力于基因调控的基础研究，在那里，她终于有了自己的技术人员，创建了一个16名博士和博士后组成的实验室。现在她有了越来越多的资金资助，也有了更为宽裕空闲的环境，她开玩笑的说，未来说不定能找到时间读读哲学。

   但现在她的时间安排得满满当当，她的焦点依然是CRISPR 系统，最近其研究组发表的一篇论文就是比CRISPR–Cas9更加简单的一种系统，他们发现CRISPR相关蛋白Cpf1具有一个以往在这一酶家族中从未观察到的特征：Cpf1对RNA和DNA显示双重切割活性。不同于CRISPR-Cas9，Cpf1能够自身加工前体crRNA，随后利用加工的RNA特异性地靶向和切割DNA。不需要宿主来源的核糖核酸酶（Rnase）及tracrRNA使得它成为了迄今为止已知最简单的CRISPR免疫系统。

   不过除了CRISPR之外，Charpentier还有另外四个项目主题，这包括病原体如何与宿主细胞相互作用，以及与调控细胞染色体行为的分子复合物相互作用的分子机制。

   至于CRISPR的专利问题，Charpentier似乎并不太关心。当时Charpentier和Doudna在 2013年3月提出专利申请，而哈佛-麻省理工的Broad研究所的张锋在2013年10月递交的申请，但由于张锋所属单位申请了特殊快速通道，他在2014年4月先于Doudna 和 Charpentier 取得专利权。因此加州大学要求 USPTO 重新审查专利资格，并提出干扰诉讼，希望真正的技术发明者能取得专利。

   其实关键问题在于，之前USPTO 是将专利授予首次发明人员，但这个规定在2013年修正，现在的专利是由先申请者得到。Doudna 和 Charpentier 在这条规定修改前就递交申请，因此一切还有待探讨解决。为此，Charpentier拒绝讨论这个问题，她表示自然有专利律师来解决。

   回顾过去，Charpentier感叹她的生活也许本来不需要如此艰难，现在有许多资助帮助年轻的研究人员创立自己的独立实验室，虽然她已经部分实现了最初的梦想，但她的脚步并未就此停止，“我并未改变，我也不会变。我成为了能让自己站在这里的科学家，这也就是我希望一直成为的科学家”，她说。

   但还是有一些东西已经发生改变了，Charpentier不再是局外人：她已经成为了原来CRISPR“小圈子”快速扩展后的权威人员，无数的团体邀请她去演讲，而她不断想做的事情就是继续报告一些完全不同，却很重要的发现，她说，“对此我已经做好了准备”。

（Alison Abbott/生物通编译）

参考文献：
Fonfara, I. et al. Nature 532, 517–521 (2016).
Novak, R., Henriques, B., Charpentier, E., Normark, S. & Tuomanen, E. Nature 399, 590–593 (1999).
Mangold, M. et al. Mol. Microbiol. 53, 1515–1527 (2004).
CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Deltcheva, E. et al. Nature 471, 602–607 (2011).
Jinek, M. et al. Science 337, 816–821 (2012).
Zetsche, B. et al. Cell 163, 759–771 (2015).
Dong, D. et al. Nature 532, 522–526 (2016).

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