CRISPR先驱Nature解析新一代CRISPR系统

　　

生物通报道  在4月20日《自然》（Nature）杂志上的一篇新研究论文中，科学家们描绘了一种新型细菌CRISPR-Cpf1系统的分子细节，这为实现其他的基因编辑应用，如平行靶向多个基因打开了可能的途径。

领导这一研究的任职于德国马克思普朗克感染生物学研究所和瑞典于默奥大学的Emmanuelle Charpentier教授。Charpentier与加州大学的Jennifer Doudna，哈佛-麻省理工大学Broad研究所的张锋博士一致被科学界公认为是CRISPR/Cas9技术开发中的重量级人物。

CRISPR-Cas是细菌免疫系统的一个组成部分，被用来抵抗病毒感染。在CRISPR-Cas9系统中，Cas9会在CRISPR RNA (crRNA)/tracrRNA复合物指定的位点切割病毒DNA。由此消灭病原体。

2011年，Charpentier和同事们描述了这一系统是由两种RNAs形成的双链RNA（tracrRNA和前体crRNA）和Cas9蛋白（从前叫做Csn1)构成，tracrRNA可加工前体pre-crRNA，使其成为成熟的crRNA。这项研究发布在Nature杂志上。2012年，Charpentier和同事们在Science杂志上发表论文证实，tracrRNA和crRNA通过碱基配对结合形成tracrRNA:crRNA二元复合体，或是将tracrRNA:crRNA二元复合体改造为融合的单向导RNA，都可以特异地引导Cas9酶到匹配的靶DNA序列处（Science：可编程的DNA剪刀）。

自那以后，CRISPR-Cas9如暴风雨般席卷许多的实验室。科学家们和临床医生们都对它寄予了极大的希望：临床医生希望能够利用这些酶剪刀来治愈一些严重的遗传疾病。
 
在2015年发表于Cell杂志上的一项研究中，哈佛-麻省理工Broad研究所的张锋及其同事们报告称发现了一种不同的CRISPR系统：CRISPR–Cpf1，其有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。他们描述了这一新系统一些出乎意外的生物学特征，证实可以操控它来编辑人类细胞基因组（张锋Cell：新一代CRISPR基因组编辑系统 ）。

在这篇最新的Nature文章中，研究人员发现了CRISPR相关蛋白Cpf1具有一个以往在这一酶家族中从未观察到的特征：Cpf1对RNA和DNA显示双重切割活性。不同于CRISPR-Cas9，Cpf1能够自身加工前体crRNA，随后利用加工的RNA特异性地靶向和切割DNA。不需要宿主来源的核糖核酸酶（Rnase）及tracrRNA使得它成为了迄今为止已知最简单的CRISPR免疫系统。将两个独立的催化部分合二为一，为实现序列特异性的基因工程操作，尤其重要的是简化一次靶向多个位点，及所谓的多路复用（multiplexing）程序开辟了可能的新途径。

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Charpentier说：“尽管CRISPR-Cas9的操作听起来简单，其相关机制细节却非常的精细。”在crRNA分子向Cas9显示切割位点之前，它需要RNA切割蛋白作用才能转变为最终形式：功能性的crRNA。其中一种RNA切割蛋白就是RNase III。2011年，Charpentier发现RNase III与tracrRNA一起参与了crRNA的成熟过程。

研究人员现在发现，一些细菌的免疫防御机制在结构上比CRISPR-Cas9要简单。除了Cas9，这些细菌利用了Cpf1来切割外源DNA。研究结果显示Cpf1可以切割RNA和DNA。Cpf1首先除去crRNA的一些组成部分，由此帮助crRNA成熟。它不需要其他RNase III一类的酶。成熟的crRNA分子随后将Cpf1引导至DNA靶序列上。

因此Cpf1具有双重功能：它赋予了crRNA功能，并随后以一种序列特异性方式切割了DNA。此外，不同于Cas9，Cpf1并不依赖于tracrRNA分子的帮助到达它的目的地。因此，它在结构上比CRISPR-Cas9要简单。“CRISPR-Cpf1是一种即插即用的系统，且不需要其他的元件。相比之下，CRISPR-Cas9在自然环境中需要助手来激活这一系统，”Charpentier说。

此外，在4月20日的Nature杂志上，来自哈尔滨工业大学、清华大学的研究人员报告称，他们获得了Cpf1/CRISPR RNA复合物的晶体结构。领导这一研究的是哈尔滨工业大学生命科学与技术学院的黄志伟教授。这篇文章揭示出了crRNA的识别机制，提供了crRNA引导LbCpf1底物结合的一些新见解，为设计改造LbCpf1提高基因编辑的效率和特异性建立了一个框架（哈尔滨工业大学Nature发表CRISPR研究重要成果  ）。

4月21日，张锋领导Broad研究所、东京大学的研究人员，在Cell杂志上揭示出了Cpf1/向导RNA/靶DNA复合物的晶体结构。这些研究结果提供了有关RNA引导Cpf1切割DNA机制的一些新见解，为合理设计建造CRISPR-Cpf1工具箱建立了一个框架（张锋Cell发表CRISPR研究新成果 ）。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA

CRISPR–Cas systems that provide defence against mobile genetic elements in bacteria and archaea have evolved a variety of mechanisms to target and cleave RNA or DNA1. The well-studied types I, II and III utilize a set of distinct CRISPR-associated (Cas) proteins for production of mature CRISPR RNAs (crRNAs) and interference with invading nucleic acids. In types I and III, Cas6 or Cas5d cleaves precursor crRNA (pre-crRNA)2, 3, 4, 5 and the mature crRNAs then guide a complex of Cas proteins (Cascade-Cas3, type I; Csm or Cmr, type III) to target and cleave invading DNA or RNA6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. In type II systems, RNase III cleaves pre-crRNA base-paired with trans-activating crRNA (tracrRNA) in the presence of Cas9 (refs 13, 14). The mature tracrRNA–crRNA duplex then guides Cas9 to cleave target DNA15. Here, we demonstrate a novel mechanism in CRISPR–Cas immunity. We show that type V-A Cpf1 from Francisella novicida is a dual-nuclease that is specific to crRNA biogenesis and target DNA interference. Cpf1 cleaves pre-crRNA upstream of a hairpin structure formed within the CRISPR repeats and thereby generates intermediate crRNAs that are processed further, leading to mature crRNAs. After recognition of a 5′-YTN-3′ protospacer adjacent motif on the non-target DNA strand and subsequent probing for an eight-nucleotide seed sequence, Cpf1, guided by the single mature repeat-spacer crRNA, introduces double-stranded breaks in the target DNA to generate a 5′ overhang16. The RNase and DNase activities of Cpf1 require sequence- and structure-specific binding to the hairpin of crRNA repeats. Cpf1 uses distinct active domains for both nuclease reactions and cleaves nucleic acids in the presence of magnesium or calcium. This study uncovers a new family of enzymes with specific dual endoribonuclease and endonuclease activities, and demonstrates that type V-A constitutes the most minimalistic of the CRISPR–Cas systems so far described.