马涵慧博士Nature Biotechnology：突破性CRISPR新技术

　　

生物通报道   来自麻省大学医学院的科学家开发出了一项利用CRISPR/Cas9的新技术：CRISPRainbow，它使得研究人员能够在活细胞中标记和追踪7个不同的基因组位点。这一标记系统将成为实时研究基因组结构的一个宝贵的工具，研究人员在《自然生物技术》（Nature Biotechnology）发布了关于它的详细资料。

领导这一研究的是麻省大学医学院的研究员马涵慧（Hanhui Ma）博士，马博士早年毕业于中国科学院上海生命科学研究院。

在2015年《PNAS》发表的一项研究中，马涵慧领导研究人员利用来自三种细菌直系同源物的催化失活Cas核酸内切酶（dCas9），设计了一种基于CRISPR的多色荧光标记系统，可特定而有区别地同时标记不同对的染色体位点。每对dCas9-荧光蛋白和同源单导向RNAs（sgRNAs），可有效地标记人活细胞内的几个靶位点。从而可让我们评估活细胞中位点之间的距离（PNAS：基于CRISPR的多色荧光标记系统 ）。

马涵慧说：“大多数人都是利用CRISPR来编辑基因组。我们正利用它在活细胞中标记DNA和追踪DNA的移动。”

马涵慧说，了解一些基因组元件在活细胞中的精确定位对于认识染色体动力学至关重要，这是因为基因是根据它们在三维空间中的位置来控制我们的生物学和健康。一个基因要转录和表达，在染色体上它必须是可接近的。DNA在拥挤细胞核中的定位对从胚胎发育到癌症一切的事物均起重要的作用。

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然而，当前的一些技术最多只能在活细胞中一次追踪三个基因组位点。标记更多的位点要求通过用甲醛来浸泡细胞固定它们，因此这会杀死细胞，使得无法观察染色体结构响应刺激或随时间推移发生的改变。

为了克服这一技术障碍，马涵慧转向了CRISPR/Cas9。为了利用CRISPR/Cas9复合物沿着基因组标记出特异的位点，马涵慧和同事们构建出了一种突变使得Cas9核酸酶失活，因此它只能结合DNA而无法切割基因组。在失活后，CRISPR/Cas9元件借助于研究人员编程的向导RNA送到基因组上的特异位点。

为了在CRISPR/Cas9复合物结合基因组后能够看到和追踪它，马涵慧设计向导RNA结合了红、绿、蓝三种原色荧光蛋白其中的一种。随后可以在显微镜下实时观察和追踪到这些蛋白。通过将第二种荧光蛋白附着到向导RNA上，马涵慧组合三种原色生成了另外三种蓝绿色、洋红色和黄色的标记。组合所有三种原色则可获得第7种白色的标记。

论文的共同作者、细胞生物学教授、生物化学及分子药理学教授Thoru Pederson博士说：“计算机与显微镜中的滤光片协同作用，可读出颜色组合，将它们显示为你要求的颜色。例如，红加绿为黄色。利用三种原色和这种称作为计算配色的方法，我们可以生成另外三种颜色。”

CRISPRainbow可同时定位多达7个不同的DNA位点，每一个具有一种独特的颜色。在活细胞中利用它增加了这种技术的能力，因为它可以追踪或许有着重要生物学影响的一些动态的基因组拓扑移动。

共同作者、麻省大学医学院生物化学与药理学助理教授David Grunwald实验室博士后Li-Chun Tu说：“有了这一技术，我们可以实时显像不同时间点的不同染色体位点。我们可以监测它们了解这些位点移动的距离和速度，我们可以看到这些结构改变如何影响正在表达的基因，以及它们与健康和疾病的关系。”

麻省大学医学院基因组三维结构研究的先锋人物Job Dekker对CRISPRainbow充满热情。“通常当我们观察基因组结构时，我们获得这一快照，并期望能够看到5分钟后当细胞响应某一事物时会是什么样子。这一系统使得人们能够实时追踪它。我认为这是一项非常重要的新技术。”

近期，由日本大阪大学医学研究生院实验动物科学研究所副教授Tomoji Mashimo，及日本信息与系统研究组织国立遗传学研究所小鼠基因组学资源实验室助理教授Kazuto Yoshimi领导的一个研究小组，开发出了两种基因改造新技术：lsODN和2H2OP。这两种方法利用了CRISPR-Cas系统和ssODN（单链寡核苷酸）。他们的研究论文发布在2016年3月的Nature Communications杂志上（Nature子刊：新型CRISPR大片段基因敲入技术 ）。

基因编辑工具CRISPR-Cas9现在可作为一种灵活、易使用的方法，靶向及追踪活细胞中RNA的活动。发布在2016年3月17日Cell杂志上的这一新方法，有可能最终可用于研究广泛的疾病相关RNA过程，及操控基因转录进行疾病建模（Cell重要突破：首次利用CRISPR技术追踪RNA ）。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow

A lack of techniques to image multiple genomic loci in living cells has limited our ability to investigate chromosome dynamics. Here we describe CRISPRainbow, a system for labeling DNA in living cells based on nuclease-dead (d) Cas9 combined with engineered single guide RNA (sgRNA) scaffolds that bind sets of fluorescent proteins. We demonstrate simultaneous imaging of up to six chromosomal loci in individual live cells and document large differences in the dynamic properties of different chromosomal loci.