血液中的宝藏：外泌体microRNA

　　

生物通报道：血液是唯一与所有器官都有接触的组织，携带着有关机体的大量宝贵信息。在理论上，检测血液携带的 DNA、RNA、囊泡和细胞残骸可以帮助人们诊断和监控各种疾病。产前基因筛查是血液检测的一个重要应用，不过其他循环生物学指标正在受到越来越多地关注，比如甲基化、RNA、微囊泡和外泌体。为了帮助大家更好的分析甲基化、分离囊泡、提取RNA、存储样本和分析数据，The Scientist杂志最近与多位专家学者探讨了检测不同血液生物学指标的策略，贡献出了相应的注意事项和实验技巧。

上接：血液中的宝藏：外泌体蛋白

研究者：Illinois大学副教授Neil Smalheiser

研究项目：从血浆外泌体鉴定阿尔茨海默症的miRNA指标

研究背景：外泌体与其他囊泡的区别主要在于尺寸、浮力密度、形成机制和特定细胞内指标。MicroRNA（miRNA）是长约22nt的非编码RNA，这些小RNA在天然细胞中大量存在，它们能与靶基因的mRNA配对，在转录后水平上调控目标基因的表达。大量研究表明，microRNA控制着胚胎发育、细胞分化、器官生成等重要的生物学过程，对于正常发育、细胞生长和生物行为非常关键，而且与复杂的神经退行性疾病有关。近来不少研究者发现，阿尔茨海默症患者的大脑组织和血液都存在miRNA水平的改变。

检测miRNA: Smalheiser团队使用了分离外泌体的传统方法——差速离心（differential ultracentrifugation）。他们用这种方法逐渐洗掉游离RNA、蛋白聚合物和细胞残骸，只留下外泌体。随后研究人员从外泌体提取RNA并对其进行测序，建立了成熟miRNA的数据集。他们通过计算模型鉴定了一组可以将阿尔茨海默症和对照准确分开的miRNA。(PLOS ONE, doi:10.1371/journal.pone.0139233, 2015)

不过，超速离心速度较慢，也无法实现高通量。此外，超速离心中有许多变量需要标准化（例如转子的选择和离心条件等等），很难转化到临床中去。好在，市场上出现了多款方便的试剂盒。比如，赛默飞世尔科技推出了几款总外泌体提取试剂盒（Total Exosome Isolation Reagent），能够分别从细胞培养基、血清、血浆、尿液及其他体液中分离出完整的外泌体。（更多详细信息参见：倾听细胞的私语：exosomes研究工具盘点）

实验技巧：研究人员使用的离心方法使他们能够获得相对纯净的外泌体，Smalheiser指出。在用Trizol试剂提取RNA的时候，他的团队发现添加糖原使产量提升了将近23%，这一步骤可以用于其它低产量RNA。

在实验室中，RNA提取过程的痛苦是众所周知的。RNA极其脆弱，对RNAses酶的降解非常敏感，而这种酶几乎无处不在。美国佛罗里达大学的研究人员为此开发了一种新的RNA提取方法，并将其发布在《Applications in Plant Sciences》上。他们将Trizol试剂、Turbo DNA试剂盒（由Life Technologies Ambion生产）和自己开发的步骤结合起来，让RNA提取变得更迅速、更有效、更可靠。（更多详细信息参见：万用的植物RNA提取法）

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