环状RNA功能研究又一利器--过表达载体[新品推荐]

环状RNA（circular RNAs,circRNA）是一类具有闭合环状结构的 RNA 分子，早在 20 世纪八十年代即有研究报道，但由于其表达丰度低，文献报道较少，一直被认为是 RNA 转录剪切的罕见错误而被忽视。直到 2012 年开始有研究者开始大批量鉴定 circRNAs，从古生菌、线虫、小鼠和人类细胞鉴定出大量 circRNAs，揭示 circRNA 大量存在于真核转录组中，是细胞基因表达的一个普遍现象，并可能发挥重要的生物学作用。进一步研究表明 circRNAs 在不同物种中高度保守，多数 circRNAs 表达水平与对应的线性 RNA 相当，部分 circRNAs 表达水平可超过线性 RNA 表达量的 10 倍，且其表达具有一定的组织、时序特异性。circRNAs 具有闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，比线性 RNA 更稳定。
 
已有研究表明 circRNAs 在中脑发育、帕金森、阿尔兹海默病和肿瘤发生中发挥重要作用。近几年研究证实或推测 circRNAs 的功能主要有：（1）充当 ceRNA 或 miRNA 海绵（miRNA sponge），通过 MRE(microRNA response element, MRE) 竞争性结合 miRNA 调节基因的表达。例如 ciRS-7/CDR1as 和 Sry 可以结合 miRNAs 而不被降解，可能是潜在的 ceRNA 分子。（2）通过碱基互补配对直接调控其他 RNA 表达。例如 CDR1as 能与 CDR1 mRNA 互补配对, 从而增强 CDR1 mRNA 的稳定性；（3）与蛋白质结合，例如 CDR1as 能与 AGO 蛋白 (Argonaute) 紧密结合。（4）作为翻译的模板指导蛋白质的合成。（5）与聚合酶 II（RNA polymerase II，Pol II）相互作用以顺式作用调控宿主转录活性。例如 circEIF3J 和 circPAIP2 通过与 U1 snRNP 和 PolⅡ形成复合体，结合到其宿主基因的启动子区域调控其表达。

图 1 已证实或推测 circRNAs 的功能

circRNAs 由于其特有的结构和复杂的功能机制，对其研究起步较晚，但已证实其具有重要的调控作用并在疾病发生中发挥重要作用，成为 RNA 和转录组研究的热点。对 circRNAs 的功能和机制研究工具也趋于成熟，circBase 数据库（http://www.circbase.org/）中已收录人的 circRNAs 9 万多个，同时收录小鼠和线虫等物种的 circRNAs。Circular RNA Interactome 数据库（http://circinteractome.nia.nih.gov/index.html）可用来预测 circRNAs 与 miRNAs 和 RBPs 的结合位点。计算机软件 find_circ(Memczak et al,2013)、CIRCexplorer(Zhang et al,2014) 和 CIRI(Gao et al,2015) 都被用来预测鉴定 circRNAs。多家公司也已推出芯片或测序方案（CircRNA-Seq）用来发现 circRNAs。

图 2 近期研究鉴定的人类 circRNAs

对于 circRNAs 的功能性过表达（Gain of function）研究，研究者多基于 circRNAs 的侧翼序列特征，PCR 分段扩增目标 circRNAs 的侧翼 Alu 序列或内含子互补序列上下游各 200-1000bp 序列和目标 circRNAs 序列，构建 CMV 启动子的表达载体。其分段扩增步骤复杂，构建周期长，且过表达倍数有限。

图 3 circRNAs 的侧翼序列特征

吉赛生物利用专利技术，成功研发出特异性准确过表达 circRNAs 的表达载体，率先为研究者提供简便高效的 circRNAs 过表达研究策略。现已推出 pCD-ciR、pLO-ciR 和 PLCDH-ciR 三种 circRNAs 表达载体，适用于普通真核表达，慢病毒包装，绿色荧光和嘌呤霉素筛选等多种用途。该载体含有吉赛生物专利技术的 circRNAs 环化表达框架，载体转染细胞后可通过 RNA 剪切形成 circRNAs 分子。研究者仅需以 PCR 扩增目标 circRNAs 的线性序列，克隆进表达载体中即可，大大简化实验步骤，节约时间。
 
应用 circRNAs 表达载体构建 100 多个目标 circRNAs 的过表达载体，并在 HEK293、SH-SY5Y、Hela、Ej、T24、HepG2 和 MHCC-97 H 等多种细胞系中完成验证，吉赛生物 circRNAs 表达载体有如下特征：
 
1）过表达效率高。circRNAs 表达载体上加有吉赛生物专利技术的上下游环化框架，验证过的所有 circRNAs 都能显著过表达 50 倍以上，最高可过表达 800 倍。
 
2）序列环化准确。环化框架内部引入吉赛生物专利技术的环化介导序列，有效保证目标 circRNAs 的线性序列准确环化，验证过的所有 circRNAs 都能准确环化，无碱基添加或缺失。
 
3）过表达稳定性高。验证过的目标 circRNAs 从 200bp 到 2500bp 序列都能实现准确高效过表达。
 
4）适用范围广。pCD-ciR 可转染细胞瞬时表达，pLO-ciR 和 PLCDH-ciR 可转染细胞瞬时表达，也可包装慢病毒构建稳定细胞系，PLCDH-ciR 可同时表达 GFP 荧光和 Puromycin 抗性基因，可以方便地进行筛选。

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