CRISPR功能研究入门指南（非编码RNA）

CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）特别适合分析非编码RNA的具体功能。最近The Scientist杂志联合CRISPR的开发者和使用者共同编写了使用CRISPRa和CRISPRi的入门指南，帮助研究者们更好的研究和调节基因组的编码和非编码区域。

生物通报道：基因组测序让我们意识到，人类基因组只有一小部分被翻译成蛋白质。其实我们基因组的80%会转录成RNA，但这些转录本大多不生成蛋白质。近年来人们发现非编码RNA往往与人类疾病有关，不过绝大多数非编码RNA的功能还是未知的。CRISPR/Cas9在这方面可以起到重要的作用。

CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）特别适合分析非编码RNA的具体功能。虽然越来越多的研究人员开始使用CRISPRa和CRISPRi，但它们其实还刚出炉不久。“我们都是这些技术的测试员，”加州大学的Jacob Corn说。

最近The Scientist杂志联合CRISPR的开发者和使用者共同编写了使用CRISPRa和CRISPRi的入门指南，帮助研究者们更好的研究和调节基因组的编码和非编码区域。

如何进入细胞

把Cas9蛋白送入细胞并不是一件容易的事，尤其是CRISPRi和CRISPRa中的改良Cas9。对于CRISPRa来说，构建始终表达Cas9或诱导表达Cas9的突变小鼠可以解决这个问题。此外，截短的引导RNA也不难进入小鼠。Konermann发现，14或15bp的引导RNA能包装进病毒（腺相关病毒AAV更好），进而注射到小鼠体内。这种短RNA不能使Cas9剪切DNA，但可以招募转录激活子。

事实上研究者们已经发现了更小的Cas9。过去我们常用的是酿脓链球菌Cas9，其实金黄色葡萄球菌Cas9要小得多，可以包装到AAV并进入细胞。虽然金黄色葡萄球菌Cas9靶标的位点要少一些，但对于转录激活来说这并不是什么大问题，Konermann指出。

测试多少引导RNA

与编辑蛋白编码基因所用的sgRNA（约20nt）相比，研究非编码RNA需要测试更多的sgRNA。Bassett进行基因编辑的时候通常设计三个引导RNA，但在CRISPRi中他会准备5-20个引导RNA。“在转录起始位点前100–200bp的区间中，我会尽可能多的尝试，”他说。预测脱靶效应的计算工具可以帮助我们缩小引导RNA的选择范围。

用CRISPRa研究非编码RNA需要测试的sgRNA就更多了，因为偏爱非编码转录本的sgRNA并不那么好找。“可能我们所知的转录起始位点对非编码RNA来说并不是那么合适，” Konermann说。“也可能非编码RNA就是更难激活。”

非编码RNA研究

CRISPRa和CRISPRi对非编码RNA研究有很大的帮助。不过这些技术都面临着一个问题，非编码RNA（特别是长非编码RNA）往往与蛋白编码基因共享一个调控区域。这个问题很难避免，但并不复杂。我们只需要查一下附近的基因，就可以通过PCR或Western blot检测这些基因的表达，了解它们是否与预定目标一同发生了改变。

虽然CRISPRa和CRISPRi很给力，但我们还需要通过其他途径探索非编码RNA的功能 。举例来说，通过CRISPR基因编辑令非编码转录本失活，有助于验证我们的研究结果。“如果你认为某个长非编码RNA有功能，最好从多种途径来证明这一点，”斯坦福大学的Jens Durruthy-Durruthy说。他在Vittorio Sebastiano实验室从事博士后研究，他所在的研究团队正在使用张锋的CRISPRa和传统的CRISPR基因编辑，研究长非编码RNA在人类发育和癌症中起到的作用。

Weissman的研究团队正在设计新的引导RNA文库，以便更有效地靶标基因组的转录起始位点。O’Connell正在对自己开发的RCas9进行改造。RCas9识别和切割RNA而不是DNA，理论上特别适合非编码RNA的功能研究。不过RCas9最初是在细胞裂解物中使用的，研究人员希望通过改良使其在细胞内有效工作。与此同时，研究者们还在寻找能够直接编辑RNA的天然CRISPR系统，这样的系统将更容易导入细胞。“我相信这样的系统肯定存在，”Bassett说。

去年七月，美国麻省理工的副教授卢冠达(Timothy Lu)在Molecular Cell杂志上发表文章，阐述了一项最新技术在非编码RNA研究领域的应用前景。这篇文章介绍了一个以CRISPR-Cas9为基础的基因组靶向技术，CRISPR-Display (CRISP-Disp)。这一技术是John Rinn博士开发的，能将大片段的非编码RNA送到指定基因组位点。研究人员摸索出的gRNA-ncRNA融合方法，能将非编码RNA带到特定DNA位点，同时不影响dCas9的功能和活性。卢冠达认为，这个系统在合成生物学和非编码RNA机理研究中具有非常大的应用潜力。（更多详细信息参见：卢冠达博士：用CRISPR揭示非编码RNA的秘密）

能与指定目标匹配的引导RNA一般不止一条，我们需要为特定基因编辑任务选择最佳的引导RNA。去年七月，哈佛医学院的研究人员开发出了一种预测软件。该软件可以准确找出合适的引导RNA，以最有效的方式实现CRISPR-Cas9基因编辑。这项重要的研究成果发布在《自然方法》（Nature methods）杂志上。（更多详细信息参见：遗传学界大牛Nature子刊发布CRISPR-Cas9新工具）

上接：CRISPR功能研究入门指南（CRISPRa）

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生物通编辑：叶予

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