微生物组研究手册（纯化篇）

微生物组研究面临的挑战并没有浇灭研究者们的热情。近年来，人类和模式动物的微生物组研究进行得如火如荼。工欲善其事，必先利其器。我们在这里介绍一些最新的微生物组研究工具和相关技术，包括基因组和转录组的纯化、生物信息学工具、质谱分析、微生物组操纵方法等等。

生物通报道：时下不少爱猫人士自封为“铲屎官”，不过相信很少有“铲屎官”会收集猫主子的便便吧。加州大学戴维斯分校的Jonathan Eisen教授正在从事这样的工作，他和同事恳请各位“铲屎官”把便便送给他们进行微生物组测序。

Eisen和Holly Ganz去年五月共同创立了Kittybiome计划，该计划旨在通过DNA测序探索猫咪身上的细菌。他们由此希望了解猫咪之间的微生物组差异，解析这些差异与猫咪行为和健康的关系。

这项工作听起来简单，做起来却并不容易。猫咪微生物组测序的样品制备和DNA提取不同于传统的海水或土壤微生物研究。选择错误的方法会改变微生物的丰度，甚至遗漏关键的菌种。此外，测序的文库制备和数据分析都容易引入序列偏好，影响微生物组研究的结论。

微生物组研究面临的挑战并没有浇灭研究者们的热情。近年来，人类和模式动物的微生物组研究进行得如火如荼。去年年底Science和Nature两大期刊发文，倡议对全球微生物群落开展大规模的系统性研究，以改善人类健康、农业、生物能源和环境。（更多信息请参见：Science、Nature发文倡议微生物组研究）

工欲善其事，必先利其器。我们在这里介绍一些最新的微生物组研究工具和相关技术，包括基因组和转录组的纯化、生物信息学工具、质谱分析、微生物组操纵方法等等。

基因组和转录组纯化

测序可以说是微生物组研究者手头最有用的工具。不过纯微生物组样品一般很难取得，NEB公司的G. Brett Robb指出。在微生物组样品中，宿主DNA占了绝大部分，有时甚至高达99%。 “在实际样品中，微生物组DNA往往跟我们不想测序的东西裹在一起。”

NEB公司的NEBNext® Microbiome DNA Enrichment Kit解决了这个问题。该试剂盒使用一个甲基化DNA结合蛋白，选择性结合并过滤宿主基因组序列。细菌（和细胞器）基因组一般缺乏真核基因组DNA的甲基化标签，因此一个简单的纯化步骤就足以将其区分开。

这个试剂盒也可以用来纯化宿主DNA，剔除细菌（或细胞器）DNA，Robb指出。举例来说，华盛顿大学和圣母大学的研究人员通过这一途径从粪便样品测序了狒狒DNA，他们将这种方法命名为FecalSeq。

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NEB公司还开发了一个产品用于测序微生物组的转录本。原核mRNA的5’末端带有核苷三磷酸，但绝大多数真核mRNA、tRNA和rRNA不具备这样的标签。NEB公司将VCE酶和一个生物素化的GTP结合起来（Cappable-seq），给三磷酸转录本标记上生物素，帮助研究者分离细菌mRNA用于转录组分析。

据Robb介绍，Cappable-seq和NEBNext试剂盒可以互补。“富集试剂盒告诉你样品里面都有哪些家伙，而Cappable-seq能读出活化的基因，告诉你这些家伙到底在干些什么。”Cappable-seq试剂目前在市场上还买不到，想要尝鲜的话还得再等一等。NEB虽然有VCE出售，但生物素化的GTP还在研发中。Robb预计该产品会在今年内面世。

最近Nature Methods杂志发布了一个名为TruSPADES的强大工具，可以大大提升研究者们测序宏基因组的能力。这种算法能将Illumina测序仪生成的300bp短读取，合并成大约1万bp的基因组片段（Synthetic Long Reads）。如果说用短读取相当于语句，那么长片段就是整章文字。显而易见，把整章文字还原成一本书要容易得多。TruSPADES主要是先给100-300bp的短读取装上条码，然后通过de brujin 图把这些片段组装起来，生成Synthetic Long Reads。这种低成本的方法可以更好的确定相连片段，获得更长更准确的长测序片段。（更多信息请参见：Nature Methods发布宏基因组测序新工具）

过去的微生物组研究主要是进行16S rDNA基因测序。随着测序成本的直线下降，针对整个菌群的宏基因组测序越来越受到青睐，因为这一技术能够提供更全面的基因组和功能信息。 J. Craig Venter研究所的研究团队在Venter本人的领导下，用不同的二代测序文库制备方法进行宏基因组测序。他们发现，文库制备方法会显著影响人类微生物组研究中的基因组和功能预测。这项研究发表在十月二十八日的美国国家科学院院刊PNAS杂志上。Venter是基因组测序的先行者，还合成了首个人造细胞，被称为“科学狂人”。（更多信息请参见：科学狂人：文库制备对宏基因组测序影响很大）