基于CRISPR-Cas9系统高通量筛选研究功能基因

　　

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利用功能缺失型（Loss-of-function）或者功能获得型（Gain-of-function） 策略高通量筛选功能基因，是研究人员快速寻找调控特定表型的重要或关键基因的主要方法。RNA干扰（RNA interference，RNAi）的遗传筛选方法因操作简单、成本相对较低等优势，尽管已经得到了广泛的应用，然而其抑制效果不完全、脱靶效应明显等劣势依然存在。近年来兴起的CRISPR/Cas9 （Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）技术能快速、简便、准确地实现基因组敲除等编辑功能，因而成为一种强大的遗传筛选工具；在各种细胞系、人、小鼠及斑马鱼等多种模式生物，大规模运用该方法筛选功能基因已经取得巨大成功。

来自北京大学工学院的研究人员总结了CRISPR/Cas9技术的特点，将其与传统基因工程方法进行了分析比较，并回顾近期相关的高通量功能基因筛选工作，最后讨论该技术未来的发展趋势。

正向遗传筛选方法被广泛应用于探究基因功能及其编码的蛋白在生命活动中所起的作用，通过诱变、鉴定特定表型及寻找对应基因，可以很好地注释基因功能和理解疾病机制。而在过去的十几年中，从基因变化研究表型变化的反向遗传学也在不断发展。以 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）等技术为基础的高通量遗传筛选方法因操作简单、成本相对较低等优势，在生命科学的研究中发挥了重要作用。然而，该技术依然存在着脱靶率高、抑制效果不完全等缺陷，难以用于解释表型变化。最近出现的 CRISPR/Cas9 （Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）系统，可以改进这些缺陷。在向导 RNA 的介导下 Cas9 可以在特异基因组位点进行切割、诱导突变，因此这一技术将正向遗传学的突变能力与 RNAi 的可设计性相结合，使得在哺乳动物细胞内进行全基因组水平的高通量基因完全敲除成为可能，为新型功能遗传筛选创造了条件。

CRISPR 系统最早于 1987 年在细菌中被发现，最近的一些研究揭示其在真细菌和古细菌中行使获得性免疫功能，抵抗外源病毒和质粒。2013 年初，研究者们利用 CRISPR/Cas的 DNA 结合活性与内切酶活性，成功地在哺乳动物细胞中对基因组进行了编辑。在Ⅱ型
CRISPR 系统中，Cas9 内切酶蛋白在外源单链向导 RNA（Single guide RNA，sgRNA）的指引下，通过碱基互补配对原则，结合到基因组靶点位置，产生双链 DNA 断裂（Doublestranded DNA breaks，DSBs），经修复引入突变。

Cas 蛋白结合靶点的关键是 sgRNA （与靶点互补的序列约 20 bp），仅改变 sgRNA 序列，即可对感兴趣的几乎任意基因组区域进行编辑。相比之下，锌指蛋白核酸酶（Zinc-finger nucleases ，ZFN ）或转录激活因子样效应物核酸酶（ Transcription activator-like effector nucleases， TALENs)等基因组编辑技术，由蛋白结构决定靶点结合特异性，在使用和制备上远不如 CRISPR/Cas 简便。因此，后者更易实现高通量、多靶点的基因组编辑，为其在高通量筛选功能基因方面的应用奠定了基础。

作者指出，利用 CRISPR 技术的遗传筛选工作已经取得了很多进展。利用各种工程化的 CRISPR 系统，以方便地编辑全基因组，并根据具体的实验需要采用敲除、抑制或激活等不同的调节方式，弥补了 RNAi、TALEN 等技术的不足。但 CRISPR 技术仍存在许多改进的空间，核心问题是如何进一步提高靶向编辑效率并降低脱靶率。围绕这两点，这篇文章从以下几个层次做进一步探讨：

第一，选择 DNA 靶点。目前常用的 spCas9 蛋白，对于任何 DNA 序列，只要求存在一段模式为“NGG”的前间区序列邻近基序 PAM，都可以成为 sgRNA 的靶点。因此，在每个目标基因的全长序列中都存在数量非常之多的候选靶点，有必要确定一些原则以挑选其中最有效者。首先，应当考虑一些基础的因素，比如利用 Cas9 蛋白切割蛋白编码基因时，应尽量靠近 N 端序列选择靶点，使得开放式阅读框架移位之后，更多的编码序列被破坏；而设计CRISPRa 靶点时，应选择在在转录起始位点之前一定距离的位置，保证各种被募集的转录激活因子不被阻碍。其次，注意考虑靶点序列的偏好性。目前已经有一些工作对 CRISPR 系统对于靶点的序列特征偏好性进行了研究。Wang 等通过免疫沉淀与逆向筛选等方法证实，具有后四位碱基为嘌呤的靶点 DNA 更易与 Cas9 结合；而 Doench 等
利用一个平铺式 sgRNA文库，对小鼠和人类的细胞表面标记进行筛选，发现新的 PAM 序列“CGGH”（H=A, C 或 T）比一般认定“NGG”PAM 效果更好。

第二，设计 sgRNA 文库。sgRNA 中决定靶点位置的 protospacer 序列长度为约 20 bp，然而其中起关键作用只是 3'端的 5~8 bp，靠近 5'端的位置出现错配时 Cas9-sgRNA 复合物与DNA 仍存在较高的结合活性，同时某链存在 Bulges 的 RNA-DNA 杂合双链也可能不影响 Cas9与靶点结合。考虑这些情况之后，sgRNA 在全基因组范围可能存在很多潜在的结合位点。研究者们试图采用一些设计策略以尽量减少脱靶可能。Fu 等设计了一种缩短的 sgRNA，从一般的 20 bp 减少为 17 bp，这种 sgRNA 在保持编辑效率的同时对错配的容忍性更低。然而，尚无高通量筛选结果支持这种短 sgRNA。另一个策略是借鉴 ZFN 与 TALEN 的设计思想，利用两个 sgRNA 引导的 Casn（Cas9 nickase）在基因组上相邻位点产生单链缺刻，产生双缺刻的位置容易发生 DSB 而单缺刻的位置将被修复；或者将 dCas9 与 Fok I 单体融合，利用双 sgRNA 募集两个 Fok I 形成二聚体产生 DSB。利用这种方法，脱靶率可以降低 1000倍，然而同时转入两个 sgRNA 在高通量筛选中将带来一些困难。

第三，优化 CRISPR 系统各组件。spCas9 是最早被研究并一直被应用的 Cas9 酶，由于其编码基因序列较长（~4.2 kb），难以装载入很多病毒载体；不仅如此，NGG PAM 也限制靶点的选择，当要求在一些特殊位点进行精确编辑时，如蛋白的一段结构域或某些 SNP 位点，其局限性尤其明显。针对这些问题，Ran 等开发了一种源自 Staphylococcus aureus 的新型 SaCas9 并成功地将其应用于哺乳动物基因组的编辑。在拥有不逊于 SpCas9 活性的同时，SaCas9 编码基因序列更短（~3 kb）且 PAM 序列存在差异（NNGRR），预示着该蛋白有着更广泛的应用潜力。而 Zetsche 等报道了一种源自 Lachnospiraceae 等菌系的 CRISPR Ⅱ型蛋白 Cpf1。 Cpf1 在 sg RNA 介导下特异性切割靶点 DNA，产生双链断裂。与 spcas9、 sacas9不同，Cpf1 家族蛋白的 PAM 序列 T 富集（T-rich）。

随着更多来自其他物种的 Cas 家族蛋白被逐渐开发，可能会找到性能更好、适用于不同实验目的新 Cas 酶。

（生物通）

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原文检索：

王干诚 马明 叶延桢 席建忠. 基于CRISPR-Cas9系统高通量筛选研究功能基因[J]. 遗传.