Nature子刊：新型CRISPR大片段基因敲入技术

　　

生物通报道  由日本大阪大学医学研究生院实验动物科学研究所副教授Tomoji Mashimo，及日本信息与系统研究组织国立遗传学研究所小鼠基因组学资源实验室助理教授Kazuto Yoshimi领导的一个研究小组，开发出了两种基因改造新技术：lsODN（long single-stranded oligodeoxynucleotide）和2H2OP(two-hit two-oligo with plasmid)）。这两种方法利用了CRISPR-Cas系统和ssODN（单链寡核苷酸）。他们的研究论文发布在近期的《细胞通讯》（Nature Communications）杂志上。

CRISPR-Cas系统使得对小鼠和大鼠进行基因改造变得很容易。通过导入Cas9信使RNA和gRNA，gRNA可以识别靶DNA，Cas9则会切割靶位点。然后通过可引起DNA突变的非同源末端连接来修复DNA断裂，就能够实现基因敲除。

同样，当导入ssODN和Cas9-gRNA时，可通过同源介导的修复（HDR）利用供体DNA来修复DNA断裂，敲入一到几十个碱基（bp）的DNA序列。虽然ssODN允许合成长达200 bp的寡核苷酸，这使得敲入诸如绿色荧光蛋白（GFP）一类的大片段DNA序列变得困难。

在这项研究中，研究人员结合了ssODNs与CRISPR-Cas系统化微调。他们首先将多聚腺苷酸尾（poly(A)）添加到表达Cas9 mRNA的质粒上，用这一CRISPR-CasCRISPR-Cas系统提高基因编辑的效率。利用Cas9-poly(A)，他们采用了两种方法来完成相对较长的DNA片段，如GFP序列的靶向基因敲入。第一种方法利用长ssODNs (lsODNs)作为靶向供体。第二种方法涉及共同注射两个gRNAs作为“剪刀”切割基因组DNA和供体质粒DNA中的靶位点，两个短ssODNs作为“浆糊”连接切割位点的末端。

利用开发出的两种基因改造方法，该研究小组成功实现了高效、精确敲入GFP基因，导入了近200kbp的大片段基因组区域（这是采取传统方法不可能做到的），并用人源基因替代了大鼠基因，构建出了基因人源化的动物。

这两种基因敲入方法将会提高在小鼠、大鼠和其他各种生物物种中进行遗传工程改造的效率，将成为构建新遗传工程生物的有用技术。研究人员高度期待这些遗传工程生物将用于药物研发、转化研究和再生医学等广泛的研究领域。

基因敲入是指利用随机整合、转座子系统、同源重组等方式将外源功能基因插入到基因组中，使其在细胞内进行表达的基因编辑技术。利用CRISPR/Cas技术可以实现外源基因的定点敲入，使遗传背景更为简单，实验操作更加精准、高效。

2015年12月，来自广岛大学的专任讲师Tetsushi Sakuma、Takashi Yamamoto教授，专任副教授Ken-Ichi T Suzuki及同事们在《Nature Protocols》杂志上，报告了一种利用基因组编辑技术的替代基因敲入方法的精简实验方案。这一创新方法被称作为PITCh系统。不同于当前的一些采用TALEN或CRISPR-Cas9基因编辑工具的技术主要利用DNA断裂修复信号通路——同源重组，PITCH系统是一种独立于HR的替代基因敲入方法（Nature子刊：TALEN/CRISPR介导的新型替代基因敲入技术 )。

2015年4月，日本TMDU的Kohichi Tanaka教授和Dr. Tomomi Aida开发了新型的高效CRISPR/Cas系统。这一成果发表Genome Biology杂志上。研究人员利用改良后的CRISPR/Cas系统，成功在小鼠受精卵的基因组中定向插入了包含EGFP（增强型绿色荧光蛋白）的长基因盒。研究显示，这一系统的长基因盒插入效率高达50%(CRISPR新改良实现高效基因敲入 )。

同月，来自中国科学院上海生命科学研究院、上海科技大学等处的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9系统开发出了一种由内含子靶向介导、可维持内源基因完整性的基因敲入方法。这一重要的研究成果发表在4月7日的《细胞研究》(Cell Research)杂志上(中科院Cell Res发表CRISPR研究新成果 )。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes

The CRISPR-Cas system is a powerful tool for generating genetically modified animals; however, targeted knock-in (KI) via homologous recombination remains difficult in zygotes. Here we show efficient gene KI in rats by combining CRISPR-Cas with single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODNs). First, a 1-kb ssODN co-injected with guide RNA (gRNA) and Cas9 messenger RNA produce GFP-KI at the rat Thy1 locus. Then, two gRNAs with two 80-bp ssODNs direct efficient integration of a 5.5-kb CAG-GFP vector into the Rosa26 locus via ssODN-mediated end joining. This protocol also achieves KI of a 200-kb BAC containing the human SIRPA locus, concomitantly knocking out the rat Sirpa gene. Finally, three gRNAs and two ssODNs replace 58-kb of the rat Cyp2d cluster with a 6.2-kb human CYP2D6 gene. These ssODN-mediated KI protocols can be applied to any target site with any donor vector without the need to construct homology arms, thus simplifying genome engineering in living organisms.