专访田见晖：体外受精引发表观修饰出错

有一个孩子，是许多不育夫妇的梦想。作为20世纪最伟大的发明之一，试管婴儿，也就是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术为许多家庭带来了福音。然而，越来越多的研究表明试管婴儿与自然受孕婴儿存在差异，这到底是为什么呢？

　　

生物通报道：有一个孩子，是许多不育夫妇的梦想。作为20世纪最伟大的发明之一，试管婴儿，也就是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术为许多家庭带来了福音。在过去将近40年时间里，成千上百万的孩子通过体外受精出生，而且这种辅助生殖技术也广泛用于牛、猪等家畜育种。

   然而，越来越多的研究表明试管婴儿与自然受孕婴儿存在差异，这不仅表现在发生出生缺陷的风险显著高于自然受孕，而且还会出现性别失衡，这到底是为什么呢？近期来自中国农业大学的田见晖教授研究组发现了其中的奥秘，他们通过一系列的表型分析，确定了这种性别失衡是由于IVF胚胎附植后出现雌性偏好性地发育异常所致，进一步研究人员认为，表观修饰错误是导致IVF胚胎及出生后代健康问题的主要原因。

   这项重要的研究发现公布《美国国家科学院院刊》（PNAS）杂志上，田教授表示，“我们的这项研究不是去否定IVF技术本身，也不是为了让不育患者放弃通过IVF获得baby，而是为了从源头上揭示这些风险的原因，并以此为IVF体系的优化提供路径，我们的最终目的是让IVF技术更加安全”。

体外受精值得放心吗？
   近年来愈来愈多夫妇受到不育问题困扰，体外受精IVF成为他们生儿育女、享受天伦之乐的一大途径，但这种技术诞生以来的最大问题就是，人们担心他们是否与自然孕育的孩子一样健康和正常。

   此前曾有跟踪调查报告显示，体外受精试管婴儿和自然孕育出生的孩子一样健康，在身体、智力、心理发育及社交能力等方面都很正常。然而另外一些研究却不那么乐观，虽然试管婴儿患癌高风险被否定了，但是自闭症、先天性心脏病、唐氏综合征等依然风险会高于正常儿童。

   “目前，全球每六对夫妇中就有一对遭受不孕不育的困扰。自1978年第一例试管婴儿出生以来，体外受精（IVF）被广泛应用于解决人类不育的问题。目前，全球已有超过540万的试管婴儿通过IVF技术出生，并以每年35万例的速度递增。但是，越来越多的证据表明尽管大多数的试管婴儿是健康的，但是仍存在令人担忧的流产、低出生重、出生缺陷、长期的疾病风险等健康问题”，田教授解释道。

X染色体失活不足
   田教授研究组博士生谭琨等在2011年发现利用体外受精技术培育的小鼠存在性别失衡问题。进一步研究显示，体外受精胚胎存在X染色体失活不足问题，他们推断这可能是导致性别失衡的主要原因。

   所谓X染色体失活，也称为里昂化（lyonization），是指雌性哺乳动物细胞中两条X染色体中的一条上的基因逐步沉默，最终X染色体会被包装成异染色质。

   基于此，田教授研究组发现 Xist 和环指蛋白12( Rnf12 )在IVF引发的XCI不足问题上发挥重要作用。Xist是一种非编码RNA，能包裹在失活的X染色体上，而Rnf12则是Xist的上游调控因子。雌性IVF胚胎中的这两种元件表达都会受损，但雄性的却不会。

   “Xist和Rnf12是X染色体失活（XCI）的关键基因，这些基因的表达受到抑制，会造成X染色体失活不足。雌性胚胎出现XCI不足问题会导致X-linked基因的过度表达, 这会导致胚胎的异常发育，进而造成性别失衡，”田教授补充道。

   此外，这项研究也证实采用实验方法上调Rnf12表达可以补偿Xist表达。进一步，田教授研究组通过将视黄酸添加到胚胎植入前培养基中，有效地逆转了小鼠IVF胚胎中这种性别比例失衡。

   “XCI是一系列的表观修饰事件，包括非编码RNAXist包裹X染色体、多种组蛋白修饰的改变及DNA甲基化变化等等。视黄酸作为一种内源性的表观修饰调节因子，可以通过作用于多能因子，激活Xist表达，进而校正XCI及出生性别比例。因此，我们尝试了通过视黄酸添加改善IVF发育体系，”田教授说，这也为探索体外受精相关的健康问题提供了参考。

表观修饰出错
   田教授说，“我们始终坚信：体外受精（IVF）操作及环境引发的表观修饰错误，是导致IVF胚胎及出生后代健康问题的主要原因，发现并校正这些表观错误可有效预防这些健康问题。围绕性别失衡问题，我们进行了一系列的表型分析，确定这是由于IVF胚胎附植后出现雌性偏好性地发育异常所致，并且这些异常雌性胚胎主要表现为胚外组织发育异常。基于这些发现，我们推断IVF雌性胚胎中XCI染色体失活这一雌性特异的表观修饰事件受到了破坏。”

   这项研究也进一步证实了这一观点，IVF操作及环境引发的表观修饰错误，是导致IVF胚胎及出生后代健康问题的主要原因，发现并校正这些表观错误可有效预防这些健康问题。这对于该领域的研究具有指引作用。针对其他的IVF健康问题，需要探索是由哪些具体的表观修饰错误引发的，进而提出针对性的解决方案。

   然而，长期以来，全世界在该领域的相关研究进展较为缓慢并缺乏突破性进展，无法有效地对IVF引发的表观错误实施针对性的校正或预防。随着试管婴儿这一群体越来越大，由此产生的健康隐患，将逐步显现。因此，田见晖教授呼吁政府和社会更加关注相关问题，从而使更多的研究人员、资金能够投入到该领域，共同解决IVF引发的一系列健康问题，使IVF能够更加安全、广泛地用于人类不育症的治疗。

应用到临床
   这项研究不仅确定了雌性偏向性妊娠丢失及随后体外受精出生性别失衡的潜在机制，而且通过针对性改良IVF过程的培养系统解决了这一IVF诱导的性别失衡问题，但是否适用于人类仍有待时间来验证。

   田教授解释道，“我们的研究是为IVF健康问题的内在机制及预防策略提供重要的方向指引。目前的研究成果在人体上应用还存在一定的问题：1）人与小鼠胚胎发育过程存在一定差异，需要进一步的证据确定物种间问题的一致性；2）伦理问题一直是人胚胎研究需要注意的，要想在人体验证这一发现，需要人自然生产的胚胎，这是不允许的；3）临床的应用（例如视黄酸添加）仍需进行一系列的风险评估，确保安全可靠。我们的研究发现小鼠、兔子、牛的IVF胚胎都存在XCI不足的问题，提示我们IVF引发的这一问题可能具有普遍性。目前，已有的人的数据表明人IVF胚胎可能也存在XCI不足问题。但是目前无法通过实验证实这一假设。

   我们认为未来的研究重点：1）揭示正常的早期胚胎发育的内在机制，特别是人类。目前，相关的机制还有很多尚不清楚，因此针对IVF引发的健康问题的机制探索更加困难；2）由于伦理的原因，我们不能直接针对人IVF胚胎开展研究，动物模型中发现的机制以及相应的预防措施是否能用于人IVF临床应用，这也将是未来研究中需要解决的问题。”

访谈花絮：
讲述科研小故事——
“这项研究，我们历时五年。研究过程中，为了确保实验证据的可信度，我们的样本都是尽可能的加大，例如证明IVF存在出生性别失衡的实验中，每组每个时间点的样本量均在500以上；实验方法也力求扎实，例如鉴定胚胎及胎儿的性别，我们结合使用了PCR、DNA-FISH、组织学观察等不同方法，尽可能的减少误判。

课题进展过程中，在验证IVF出生性别失衡是否由XCI不足所致，我们进行了一系列的分析及实验工作，最终终于解决这一问题。总而言之，科学研究需要的是行动上吃苦耐劳、持之以恒，思想上开放创新。”

中国农业大学动物科技学院田见晖教授为该研究的通讯作者。中国农业大学动物科技学院博士生谭琨、副教授安磊、博士苗凯为本文共同第一作者。北京大学实验动物中心朱德生教授和刘敬浩老师以及美国加州大学陈东宝教授、麻省医学院Ingolf Bach 教授参与了这一工作。

通讯作者简介：
田见晖
动物遗传育种与繁殖专业农学博士；教授，博士生导师。
先后入选“北京市科技新星计划”，“教育部新世纪优秀人才支持计划”及“教育部****特聘教授”。主要从事卵母细胞成熟与胚胎发育调控、诱导多能干细胞（iPS）重编程等方向的研究，重点关注表观修饰参与上述过程的调控机制。

以第一作者或通讯作者先后在Nat Commun，Cell Res、J Pineal Res、J Proteome Res、PLoS One、BiolReprod、Reproduction、Theriogenology、AnimReprodSci 等相关领域重要期刊发表SCI论文20余篇，授权专利11项，获省部级科技奖励4项。

主要学术兼职：
　　1. 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会秘书长兼副理事长
　　2. 畜禽育种国家工程实验室副主任
　　3. 农业部动物遗传育种与繁殖学科群副主任
　　4. 国家“十二五”农业与农村科技发展规划专家组成员
　　5. 国家“十一五”、“十二五”“863”计划“动物分子与细胞工程育种”重大专项首席专家

主持及承担科研项目：
　　1.国家自然基金面上项目，31472092，体外胚胎出生性别比例失衡的分子机制研究，2015.01-2018.12
2. 863课题，2011AA100303，家畜卵母细胞冷冻、胚胎表观修饰和体细胞克隆技术研究，2011.01-2015.12
　　3. 863课题，2008AA101003，家畜卵泡高效诱导发育技术研究与应用，2008.01-2011.12
4. 支撑计划课题，2006BAD14B08，畜禽良种资源高效繁殖和生殖健康关键技术研究，2006.11-2008.12

原文摘要：
Impaired imprinted X chromosome inactivation is responsible for the skewed sex ratio following in vitro fertilization
链接：http://www.pnas.org/content/early/2016/03/02/1523538113.full
Dynamic epigenetic reprogramming occurs during normal embryonic development at the preimplantation stage. Erroneous epigenetic modifications due to environmental perturbations such as manipulation and culture of embryos during in vitro fertilization (IVF) are linked to various short- or long-term consequences. Among these, the skewed sex ratio, an indicator of reproductive hazards, was reported in bovine and porcine embryos and even human IVF newborns. However, since the first case of sex skewing reported in 1991, the underlying mechanisms remain unclear. We reported herein that sex ratio is skewed in mouse IVF offspring, and this was a result of female-biased peri-implantation developmental defects that were originated from impaired imprinted X chromosome inactivation (iXCI) through reduced ring finger protein 12 (Rnf12)/X-inactive specific transcript (Xist) expression. Compensation of impaired iXCI by overexpression of Rnf12 to up-regulate Xist significantly rescued female-biased developmental defects and corrected sex ratio in IVF offspring. Moreover, supplementation of an epigenetic modulator retinoic acid in embryo culture medium up-regulated Rnf12/Xist expression, improved iXCI, and successfully redeemed the skewed sex ratio to nearly 50% in mouse IVF offspring. Thus, our data show that iXCI is one of the major epigenetic barriers for the developmental competence of female embryos during preimplantation stage, and targeting erroneous epigenetic modifications may provide a potential approach for preventing IVF-associated complications.