Cell发布CRISPR/Cas9重要研究成果

　　

生物通报道  来自东京大学、麻省理工学院与哈佛大学Broad研究所的研究人员，在新研究中揭示出了新凶手弗朗西丝菌Cas9(FnCas9)的结构，并利用这一结构信息对FnCas9进行改造构建出了一个变异体。研究成果发布在2月25日的《细胞》（Cell）杂志上。

东京大学医学科学研究所基础医学系Osamu Nureki教授，及Nureki实验室生物物理学和生物化学助理教授Hiroshi Nishimasu是这篇论文的共同通讯作者。Broad研究所核心成员张锋（Feng Zhang）博士是这篇论文的合著作者。2014年2月，张锋曾与Nureki教授联手合作生成了CRISPR/Cas系统关键组成部分——Cas9复合体的第一张高分辨率图像。这一重要的研究成果发布在Cell杂志上（CRISPR研究先锋张锋博士Cell发表最新成果 ）。

来自CRISPR- Cas系统的RNA引导DNA核酸内切酶Cas9，可以结合双RNA导向序列crRNA （CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating RNA)，或合成的单导向RNA(sgRNA)，切割与导向RNA互补的双链靶DNA。当前有几种Cas9直系同源物，例如化脓性链球菌Cas9 (SpCas9)和金黄色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)已被利用于真核生物细胞中实现基因组编辑。科学家们还在致力不断地改进这些技术。

在发表于2015年11月Nature Biotechnology杂志上的一篇研究论文中，研究小组报告称演化出了SaCas9的一种变体，它能够识别更广泛的核苷酸序列，靶向以往CRISPR-Cas9技术无法触及的基因组位点（Nature Biotechnology：扩大CRISPR-Cas9的靶向范围 ）。

2015年12月，张锋领导麻省理工学院-哈佛医学院Broad研究所和麻省理工学院McGovern脑研究所的研究人员，设计改造了革命性的CRISPR-Cas9基因编辑系统，大大减少了“脱靶”编辑错误。这一完善的技术解决了使用基因组编辑时面对的一个主要技术问题。研究论文发表在Science杂志上（张锋Science重大突破：攻克CRISPR-Cas9基因组编辑的主要障碍 ）。

除了要求RNA-DNA互补配对，Cas9识别和切割DNA还需要在靶DNA序列的邻近下游存在“PAM”（ protospacer adjacent motif）的短DNA序列，由此限制了Cas9介导基因组编辑可靶向序列的范围。来自不同微生物的Cas9直系同源物识别不同的PAM序列，SpCas9和SaCas9分别识别5′-NGG-3′和5′-NNGRRT-3′ PAMs。

Cas9直系同源物的长度和序列具有高度的差异，氨基酸残基的数量在大约900-1600之间，FnCas9是最大的成员之一。FnCas9包含1,629个氨基酸，相比于其他的Cas9直系同源物如SpCas9 (1,368个氨基酸)和SaCas9 (1,053个氨基酸)要大得多。值得注意地是，以往的一项研究报道FnCas9不仅可以介导crRNA:tracrRNA依赖性DNA切割，还可介导scaRNA（小CRISPR/Cas相关RNA）:tracrRNA依赖的基因表达调控。但目前对于FnCas9执行其双重功能的机制仍不清楚。此外，也尚未探索FnCas9在基因组编辑应用中的潜力。

在这篇Cell新文章中研究人员报告称，获得了FnCas9–sgRNA–靶DNA复合物的晶体结构，分辨率达到1.7 埃（Å）。通过比较FnCas9和其他Cas9直系同源物SpCas9 与SaCas9，揭示出了亲缘关系遥远的CRISPR-Cas9系统之间的保守特征及惊人的结构差异。他们发现FnCas9识别的是5′-NGG-3′ PAM，并利用这一结构信息构建出了一个识别5′-YG-3′ PAM的Cas9异构体。此外，研究人员证实可以将预组装的FnCas9–sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物通过显微注射到小鼠受精卵中编辑具有5′-YG-3′ PAM的内源性位点，由此扩大了CRISPR-Cas9工具箱的靶向空间。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Structure and Engineering of Francisella novicida Cas9

The RNA-guided endonuclease Cas9 cleaves double-stranded DNA targets complementary to the guide RNA and has been applied to programmable genome editing. Cas9-mediated cleavage requires a protospacer adjacent motif (PAM) juxtaposed with the DNA target sequence, thus constricting the range of targetable sites. Here, we report the 1.7 Å resolution crystal structures of Cas9 from Francisella novicida (FnCas9), one of the largest Cas9 orthologs, in complex with a guide RNA and its PAM-containing DNA targets. A structural comparison of FnCas9 with other Cas9 orthologs revealed striking conserved and divergent features among distantly related CRISPR-Cas9 systems. We found that FnCas9 recognizes the 5′-NGG-3′ PAM, and used the structural information to create a variant that can recognize the more relaxed 5′-YG-3′ PAM. Furthermore, we demonstrated that the FnCas9-ribonucleoprotein complex can be microinjected into mouse zygotes to edit endogenous sites with the 5′-YG-3′ PAM, thus expanding the target space of the CRISPR-Cas9 toolbox.