miRNA诊断媒介：未来新型癌症检测手段

　　

近年来以血液、唾液、尿液各类miRNA和表面蛋白检测为手段，对癌症细胞进行病前诊断已经成为一种趋势。与此同时，“外泌体”和“囊泡”这两个词语逐渐被科研工作者所熟知。关于探索外泌体的工作也随之增加。

那么读者想问了，什么是外泌体？什么是囊泡？它们与miRNA有何关系？怎么获得外泌体和囊泡？在众多方法中哪个方法对提取的纯度，质量，数量最佳？最优提取方法的原理？下面小编为大家的疑问一一解答。

何为“外泌体”何为“囊泡”？

1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。细胞外囊泡（EV）即外泌体（φ40-100nm）和微泡（φ100-1000nm），充当细胞间网络的信使，允许细胞之间的细胞组分交换。因此可以看出外泌体即为囊泡。

与miRNA的关系？
2007年， Valadi等发现鼠的肥大细胞分泌的 exosome可以被人的肥大细胞捕获，并且其携带的mRNA成分可以进入细胞浆中可以被翻译成蛋白质，不仅仅是mRNA，exosomes所转移的microRNA同样具有生物活性，在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平。这一发现使得研究人员对exosome的研究热情激增，截止目前已经通过286项研究发现了41860种蛋白质、2838种microRNA、3408种mRNA。

提取囊泡EV的方法？
超速离心法（UC）、聚乙二醇（PEG）沉淀法、特异性抗体法、PS亲合法。

在众多方法中哪个方法对提取的纯度，质量，数量最佳？最优提取方法的原理？

①超速离心法这是目前外泌体提取最常用的方法。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，而且此方法需要具有有限的并行处理能力的昂贵的仪器。②聚乙二醇（PEG）沉淀法由于小的和易碎的颗粒或沉降效率，收集的外泌体的量不一致。由于其简单性和可行性而获得普及的替代方法是基于聚合物的沉淀。虽然该方法有效地回收外泌体，但大量的非外泌体污染物也同时沉淀，这些污染物干扰后续分析。③特异性抗体法：通过使用针对外泌体特异性表面蛋白例如CD9，CD63和CD81的抗体亲和纯化分离外泌体的方法。然而，这些方法不能用于分析完整外泌体的功能，因为通过使用温和的洗脱条件难以将结合的外泌体从抗体或外泌体结合分子上分离。由于这些问题，研究者渴望开发一种可行的方法来分离高度纯化和完整的外泌体的时候，PS亲合法让他们眼前一亮。

 
PS亲合法：通过使用T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白域包含蛋白4（Tim4）分离高度纯化的外泌体。Tim4是在巨噬细胞上表达的I型跨膜蛋白，其强烈结合磷脂酰丝氨酸，不仅显示在凋亡细胞上，而且显示在外泌体和微泡。使用Tim4蛋白，其特异性结合显示在外泌体表面上的磷脂酰丝氨酸。因为结合是Ca2+依赖性的，完整的外泌体可以通过添加Ca2+螯合剂容易地从Tim 4释放。值得注意的是，利用PS亲和法提取的外泌体纯度之高可以用过质谱显示的。还用于从细胞条件培养基沉淀中分离大外泌体和通过ELISA、流式细胞术对外泌体的灵敏定量。这些结果表明通过Tim4蛋白纯化的有用性表征Evs的真正功能。（Wataru Nakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez etl.A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles[J]NATURE, Scientific Reports 6, Article number: 33935 (2016). doi:10.1038/srep33935）

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与传统方法比较
方法	纯度	外泌体回收率	完整囊泡
MagCapture™（PS亲和）	■■■■■	■■■■	○
超速离心法	■■■	■■■	○
多聚物沉淀	■	■■■■■	○
表现抗体亲和（抗体）	■■■■	■■	×

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