从Nature到Cell，多篇顶级论文指出CRISPR/Cas9系统不可或缺的元件

CRISPR/Cas9系统存在误差，这会给基础研究，尤其是人体疾病治疗应用带来意外伤害，加拿大，美国的一个研究组发现了3个能够抑制Cas9酶的天然蛋白质家族，这不仅发现了CRISPR/Cas9系统不可或缺的关闭开关，而且还指出天然存在Cas9抑制剂，能够开发利用。

　　生物通报道：CRISPR/Cas9系统由两部分组成：分子剪刀Cas9能切断DNA，但在其天然状态无法发挥功能，另外一个部分是导向RNA复合物，在出现匹配的基因序列时解锁Cas9，找到准确的位置切开序列。科学家们在哺乳动物中利用人工的导向RNA重编程CRISPR/Cas9 系统，在细胞中精确插入新的遗传信息片段，精确有效的完成了之前需要数月或者数年工作量的实验设计。

但CRISPR/Cas9 系统并不是完全精确，有时导向RNA会靶向相似序列，导致脱靶，这种不匹配位点在人体基因组的60亿个核苷酸中出现频率多达100倍，这会给实验，尤其是人体疾病治疗应用带来意外的伤害，再加上伦理学上的争议，因此许多科学家们对CRISPR平台的应用慎之又慎，一些Anti-CRISPR系统的出现则能为认识和操控CRISPR提供大量有价值的工具。

早在2012年，来自多伦多大学Alan R. Davidson领导的一个研究小组第一次证实一些基因介导了对CRISPR/Cas系统的抑制作用。他们在感染绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）的细菌噬菌体中发现了5个不同的I-F型 “anti-CRISPR”基因，并证实噬菌体anti-CRISPR基因突变使得它无法感染具有功能性CRISPR/Cas系统的细菌。

去年这一研究组在Nature杂志上发文，确定了其中三种anti-CRISPR蛋白：AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能机制，研究人员发现每一个anti-CRISPR蛋白都通过不同的机制来抑制了CRISPR-Cas的活性。比如说，AcrF3通过阻止招募Cas3将CRISPR-Cas系统转变为了一个基因调控因子。研究人员指出，这些anti-CRISPR蛋白质不同的序列及作用机制表明了独立的进化，并预示了还存在其他的方式——蛋白质借助于它们改变了CRISPR–Cas的功能。

在这些研究的基础上，近期这一研究组与麻省大学Erik J. Sontheimer教授合作，鉴定出了3个能够抑制Cas9酶的天然蛋白质家族。这些抑制性蛋白能直接绑定NmeCas9（N. meningitidis Cas9），而且更重要的是，这些anti-CRISPRs能够被作为人类细胞基因编辑的有效抑制剂。

Davidson博士说，“CRISPR是一个非常强大的基因编辑工具，但我们必须能够关掉它。这种关闭工具的发现将能帮助研究人员对CRISPR系统更有信心。”

CRISPR/Cas9 系统可以靶向靶标细胞，但也有可能会影响其它辅助细胞，组织或者器官。Cas9酶在这些细胞，组织器官中的活性无用，且会造成安全风险。如果构建一种关闭开关，那么就能确保Cas9不会在除了靶标组织以外的地方滥用，组织特异性就能提高。

这一新研究不仅发现了关闭开关，而且还指出Cas9抑制剂天然存在，能够被开发利用。

（生物通：张迪）

原文摘要：

Naturally Occurring Off-Switches for CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 technology would be enhanced by the ability to inhibit Cas9 function spatially, temporally, or conditionally. Previously, we discovered small proteins encoded by bacteriophages that inhibit the CRISPR-Cas systems of their host bacteria. These “anti-CRISPRs” were specific to type I CRISPR-Cas systems that do not employ the Cas9 protein. We posited that nature would also yield Cas9 inhibitors in response to the evolutionary arms race between bacteriophages and their hosts. Here, we report the discovery of three distinct families of anti-CRISPRs that specifically inhibit the CRISPR-Cas9 system of Neisseria meningitidis. We show that these proteins bind directly to N. meningitidis Cas9 (NmeCas9) and can be used as potent inhibitors of genome editing by this system in human cells. These anti-CRISPR proteins now enable “off-switches” for CRISPR-Cas9 activity and provide a genetically encodable means to inhibit CRISPR-Cas9 genome editing in eukaryotes.