Nature公布CRISPR最新研究突破：修复遗传病细胞

　　

生物通报道：镰状细胞病（Sickle Cell Disease）是我们都挺熟悉的一种隐性基因遗传病，因患者大部分红细胞呈镰刀状而冠名，在我国南方地区出现过不少此类病例。迄今为止还没有能真正治愈这种疾病的药物，百年来唯一获批的药物仅有一个，这让不少科学家将希望寄托在基因治疗上。

斯坦福大学医学院的研究人员利用CRISPR基因编辑技术，在人体干细胞中修复了造成镰状细胞贫血病的基因，这将是在研发针对这种疾病的基因治疗道路上走出了关键的一步。

这一研究成果公布在11月7日的Nature杂志上，文章的第一作者Daniel Dever博士与Rasmus Bak博士，通讯作者是斯坦福大学医学院教授、CRISPR Therapeutics公司创始人Matthew Porteus 博士。Porteus博士在博士后工作期间开始进行基因组编辑方面的研究，他首次发现，可以利用人工核酸酶，通过同源重组通路，对人类细胞基因组进行精确修饰，从而影响特定基因的表达。目前，Porteus博士主要进行遗传性疾病基因组修饰疗法的研究开发。

这项最新研究证明了修复后的细胞能生成正常功能的血红蛋白分子，在正常红细胞中可以携带氧气，这些干细胞也可以正常移植到小鼠体内。研究人员指出这项研究表明针对血源性遗传疾病，比如镰刀状细胞贫血症，和地中海贫血，可以进行基因治疗修复，这是一种概念证明。

痛苦的疾病
镰状细胞病是一类由于HBB基因发生突变造成的遗传性血液疾病，HBB基因发生突变会产生异常的血红蛋白---一种正常条件下允许血细胞携带氧气的含铁蛋白，从而导致红细胞变得坚硬和粘稠而且形状类似于弯曲的称作镰刀的农场工具。在HBB基因突变造成的两种主要性疾病，镰刀形细胞贫血症和β-地中海贫血症中，红细胞都不能有效地携带氧气，其中镰刀状细胞病会造成手脚肿大，由于血管堵塞引起的疼痛，贫血和中风。

这些疾病在非洲、地中海和中东来源的人们中间最为常见。根据美国疾病防控中心提供的数据，每500名非洲裔美国人就有一个人和每3万名拉丁裔美国人就有一个人出生时就携带这种镰刀形细胞疾病。

这种疾病能够通过干细胞或骨髓移植而得以治愈，但是也存在较高的风险：接受移植的受者可能会排斥捐献的骨髓或细胞，能够导致严重的副作用，甚至死亡。

为基因治疗带来新希望
基因治疗虽然早在上个世纪八十年代就曾被提出来，但是一直以来都只有零星成果，但这项研究不仅为镰刀型细胞贫血症等血液疾病带来了福音，也为基因治疗提出了新希望。

Porteus说，“最终这项研究表明我们可以做到。这不仅仅只存在于黑板上，我们可以从患者体内采集干细胞，然后进行修复，研究显示这些干细胞能生成正常的血红细胞。”

以往的研究主要都是通过旧的基因编辑技术，但这项新发现采用了CRISPR 技术，“我们花了6年时间，希望能通过当时的技术来靶向β-球蛋白，”而CRISPR实验只进行了一个星期，效果就要好得多。

CRISPR是指规律成簇的间隔短回文重复，细菌通过CRISPR与内切酶Cas组成的防御系统对抗外来侵略者。CRISPR-Cas能根据向导RNA的指引切割入侵者的遗传物质。2012年研究者们利用这一特点，将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。

利用这种技术，研究人员可以在你希望的位置进行剪切，比如这项研究就是在镰状细胞突变处，一旦突变DNA序列被剔除，那么就可以利用其它工具粘上一个正常的序列拷贝。

Porteus研究组首先从患者体内取出干细胞，利用CRISPR纠正基因突变，然后浓缩干细胞，这样90%都会携带纠正过的细胞基因。这种干细胞是一种特殊的干细胞——造血干细胞，最后研究人员将这种浓缩后，纠正过了的造血干细胞注入到幼鼠体内。

“这些干细胞能从血液系统正常进入骨髓，然后开枝散叶，制造血液细胞，”Porteus说。16个星期后，研究小组检查小鼠骨髓，发现纠正后的干细胞蓬勃发育。

这些细胞无需完全替换患者体内所有的镰状细胞，只要镰状细胞的比例低于30%，那么患者就不会出现症状了。而且纠正过的细胞相对于镰状细胞具有优势，因为后者一般来说平均10天后就会死亡，而纠正后的细胞能生活大约120天。

安全吗？
虽然基因治疗的研究近年来取得了很大的进步，但它尚未广泛推广，并且CRISPR 编辑基因也没有在人体临床实验中进行炎症，那么这就存在一个问题，它们安全吗？会不会出现未知的免疫反应，或者改变非靶标DNA序列，也就是脱靶呢？

对此Porteus表示，我们无法完全证明其安全性，只能说让我们进行检测，看看它是否安全，完全安全的检测是不存在的。他认为系列不同的实验也许能对提供一些安全性的资料。到目前为止，这项研究中的纠正造血干细胞与正常的健康造血干细胞没有发现区别。

（生物通：张迪）

原文摘要：

CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells

The β-haemoglobinopathies, such as sickle cell disease and β-thalassaemia, are caused by mutations in the β-globin (HBB) gene and affect millions of people worldwide. Ex vivo gene correction in patient-derived haematopoietic stem cells followed by autologous transplantation could be used to cure β-haemoglobinopathies. Here we present a CRISPR/Cas9 gene-editing system that combines Cas9 ribonucleoproteins and adeno-associated viral vector delivery of a homologous donor to achieve homologous recombination at the HBB gene in haematopoietic stem cells. Notably, we devise an enrichment model to purify a population of haematopoietic stem and progenitor cells with more than 90% targeted integration. We also show efficient correction of the Glu6Val mutation responsible for sickle cell disease by using patient-derived stem and progenitor cells that, after differentiation into erythrocytes, express adult β-globin (HbA) messenger RNA, which confirms intact transcriptional regulation of edited HBB alleles. Collectively, these preclinical studies outline a CRISPR-based methodology for targeting haematopoietic stem cells by homologous recombination at the HBB locus to advance the development of next-generation therapies for β-haemoglobinopathies.