中美学者Nature第一次发现CRISPR的新编辑作用：非分裂细胞基因编辑

Salk研究院，广州医科大学等处的研究人员第一次发现基因编辑技术可以在非分裂细胞的靶定位置上插入DNA，这种技术被证明可以部分恢复失明啮齿类动物的视觉反应，这将为基础研究和许多临床治疗，如针对视网膜、心脏和神经系统的疾病打开了一扇新的窗口。

　　生物通报道：Salk研究院，广州医科大学等处的研究人员第一次发现基因编辑技术可以在非分裂细胞靶定位置上插入DNA，这种技术被证明可以部分恢复失明啮齿类动物的视觉反应，这将为基础研究和许多临床治疗，如针对视网膜、心脏和神经系统的疾病打开了一扇新的窗口。

这一研究成果公布在11月16日的Nature杂志上，文章的通讯作者是Salk研究院的著名学者Juan Carlos Izpisua Belmonte教授，他表示，“我们感到非常兴奋，因为这是利用之前的技术不可能完成的。这也是第一次我们可以进入非分裂细胞中，按照自己的意愿修改DNA，其应用的前景非常广阔。”

参与这项研究的还包括广州医科大学的张康（Kang Zhang）教授，中科院动物研究所的曲静（Jing Qu ）研究员等人。

到目前为止，编辑修改DNA的技术，如CRISPR-Cas9 系统都主要在分裂细胞中有效，像是皮肤细胞或肠道细胞，采用的是细胞内的正常复制机制。

而最新这项Salk技术在将新DNA整合到培养分裂细胞中的效率方面，要比之前的技术高出10倍，因此未来将能在基础研究和临床应用方面发挥重要的作用。但更重要的是，这种技术第一次能帮助科学家们将一个新的基因插入到成体细胞的精确位置上，这种细胞不再分裂，如眼睛、大脑、胰腺或心脏中的细胞，这将为在这些细胞中的治疗应用提供了新的可能。

最开始，Salk研究院的研究人员靶向了一种DNA修复细胞途径—— NHEJ （non-homologous end-joining，非同源末端连接），这个途径能通过重新连接DNA末端来修复常规的DNA断裂。他们将这个过程与现有的基因编辑技术想结合，成功的将新的DNA放入了非分裂细胞中的一个精确位置。

“利用这种 NHEJ 通路插入全新的DNA革新了活体成体生物基因组编辑技术，”文章作者之一，Izpisua Belmonte实验室研究员Keiichiro Suzuki说，“从来没有人这样做过。”

首先，Salk研究组利用 CRISPR-Cas9 系统优化了 NHEJ机器，从而DNA能插入到基因组中非常精确的位置上，由此研究人员构建了一种由核酸鸡尾酒组成的定制插入包，他们将其命名为 HITI（homology-independent targeted integration，同源独立靶向整合，生物通译）。然后研究人员通过一种惰性病毒将 HITI 的遗传指令包传递到人体胚胎干细胞中神经元里。

文章第一作者之一，吴骏（Jun Wu，音译）说，“这是第一次表明HITI能在非分裂细胞中发挥作用，”在此基础上，研究人员又成功的将指令传递到成鼠大脑。

最后为了探讨 HITI 在基因基因置换治疗中的作用，研究人员又在患有视网膜色素变性的大鼠模型中进行了验证，视网膜色素变性是一类视功能进行性损害的遗传性视网膜病变，引发患者失明。这一次研究人员利用 HITI 将一个功能性Mertk拷贝（视网膜色素变性损伤的基因之一）传递到了一只3周龄大鼠眼中。结果证明当这只大鼠长到8周龄，它能对光产生反应，并且几个测试都证明它的视网膜细胞正在愈合。

“我们能够改善这些失明动物的视力，这个早期成功案例表明，这种技术很有前景。”文章第一作者之一Reyna Hernandez-Benitez说。

研究组下一步将会提高 HITI 的传送效率，和所有的基因组编辑技术一样，要想得到整合进新DNA的足够多细胞并不容易，HITI技术的优势在于它能适用于任何靶向基因组工程系统中，而不仅仅是CRISPR-Cas9，因此这些细胞的安全性和高效率，也将成为 HITI的优势。

“现在我们有了能编辑非分裂细胞中DNA的技术，能修复大脑、心脏、肝脏中破损的基因。这是第一次让我们离治愈疾病的梦想如此之近，这令人非常兴奋”，Izpisua Belmonte说。

（生物通：张迪）

原文摘要：

In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration

Targeted genome editing via engineered nucleases is an exciting area of biomedical research and holds potential for clinical applications. Despite rapid advances in the field, in vivo targeted transgene integration is still infeasible because current tools are inefficient1, especially for non-dividing cells, which compose most adult tissues. This poses a barrier for uncovering fundamental biological principles and developing treatments for a broad range of genetic disorders2. Based on clustered regularly interspaced short palindromic repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9)3, 4 technology, here we devise a homology-independent targeted integration (HITI) strategy, which allows for robust DNA knock-in in both dividing and non-dividing cells in vitro and, more importantly, in vivo (for example, in neurons of postnatal mammals). As a proof of concept of its therapeutic potential, we demonstrate the efficacy of HITI in improving visual function using a rat model of the retinal degeneration condition retinitis pigmentosa. The HITI method presented here establishes new avenues for basic research and targeted gene therapies.