专访胡兴斌：深入探索造血微环境的奥秘

　　

生物通报道：造血干细胞是一群具有自我更新及分化能力的多能干细胞，可以分化为所有类型的成熟血液细胞，在机体中扮演了重要的角色，造血微环境对于造血干细胞行使功能具有关键的调控作用，但直到最近几年，造血微环境的细胞和分子基础才逐渐明晰。

近期来自City of Hope医学中心和第四军医大学的联合研究小组，采用肾脏包膜异位成骨移植、单细胞定量PCR技术、基因敲除小鼠和特异性细胞清除等方法，证实骨相关的Sca1+基质前体细胞可发育成为造血微环境的构成细胞，从而调控造血干细胞自我更新和分化。

这项研究公布在《自然通讯》（Nature Communications）杂志上，揭示了参与Niche构建的细胞亚群之间的世代次第关系及功能，为异常造血调控干预和造血干细胞应用指明了新方向。

文章的第一作者是第四军医大学附属西京医院的胡兴斌副教授，为了更深入了解这项研究，生物通特联系了胡兴斌副教授，就读者感兴趣的一些问题请教了他。

生物通：在造血微环境（Niche）这一概念还未面世之前，科学家们已确定了大量关于干细胞的生成及分化机制，然而近年来造血干细胞本身研究领域进展不大，这其中一个关键性的障碍就是对于体内造血干细胞所处的微环境知之甚少，因此您的这项研究显得尤为重要，您能具体谈谈这种细胞亚群之间的世代次第关系对于这一领域的基础研究和临床应用的重要意义吗？

胡教授：造血干细胞是研究最早、最多、最深入的干细胞，40多年前人们已经认识到造血微环境对造血调控的重要意义，并提出了Niche概念和学说，直到最近几年，Niche构建组成的细胞和分子基础才逐渐明晰。

目前多个研究小组采用不同的细胞标记，证实不同类型的细胞亚群，如成骨细胞、内皮细胞、脂肪细胞、施万细胞和血管周的基质细胞，以及nestin+间充质细胞、LeptinR+细胞、CAR 细胞、Mx1+基质细胞等，参与Niche构建。但是此前一直不清楚这些细胞亚群之间的发育、重叠关系，这些构建细胞在维持和调控HSC时是否具有功能上的协同或拮抗也值得深入研究。

我们小组证实成体骨相关的Sca1+、CD146+和CD166+亚群参与Niche的构建，并且Sca1+细胞可分化为CD146+、CD166+细胞，为全面解析Niche的组成和构建进程奠定了重要基础。

阐明Niche构建细胞之间的世代次第关系，不但有助于阐明Niche的组成及构建过程，更对合理应用造血干细胞和干预造血微环境具有重要意义。由于直接干预造血干细胞的手段、进展比较有限，因此科学家们将大量精力投入到了研究干涉Niche的可能性上面。回答了Niche构建细胞之间的进程和关系，就有可能十分精准的干预造血微环境，使异常造血的治疗或预防走上精准之路。

生物通：不少读者都不是很了解肾脏包膜异位成骨移植这项技术，您能给我们介绍一下吗？此外，这项研究采用了多种重要技术，分别是用在了哪些方面？

胡教授：在研究造血微环境过程中，如何有效模拟体内环境是一大技术难题。虽然皮下注射成骨方式也被广泛使用，但这类技术所需细胞数量多，效率较低，需要长达8周的实验周期；肾脏包膜异位成骨也属体内研究，比体外诱导实验更接近体内实际，在Niche研究中已经使用多年。而小鼠肾脏包膜下本身无骨组织，且血供十分丰富，可大大缩短实验周期，4周即可成骨；该技术需要进行外科手术操作，而且肾脏包膜下空间很小，注射体积就能容纳10微升左右，实验操作难度较大。

我们研究中还采用了单细胞定量PCR技术和免疫荧光染色全片扫描技术。干细胞数量少，直接进行常规的基因、蛋白分析十分困难，而单细胞技术是近年研究的热点技术，我们利用流式分选，获得单个细胞，结合高通量的单细胞qRT-PCR技术，分析了Sca1+、CD146+和CD166+亚群的基因表达水平，从而为揭示三种细胞的次第关系提供了基因表达模式特征证据，是功能学分析的有力支撑。常规形态学分析时，采集图像往往只能做到单视野，难以全面反映切片组织形态的整体特征，我们对长骨冰冻切片后，免疫荧光多重染色，采集图像信号时，利用了全片扫描的技术，即将整个切片上的荧光信号全部收集，再进行整体分析，能更加全面、客观反映形态学特征，但是该方法获取的图像数据量大，对电脑硬件要求较高。

在实验过程中遇到的另一大难题是如何清除小鼠Niche 中的Sca1+前体细胞。通过多种基因敲除技术的尝试，最终我们利用Cre-DTR系统，特异性的将Sca1+前体细胞清除，从而能够反映出在没有Sca1+前体细胞条件下，CD146+和CD166+亚群的生成和HSC数量改变。

生物通：研究证实，骨相关的Sca1+基质前体细胞可发育成为造血微环境的多种构成细胞，那么是否可以将其应用在造血干细胞移植治疗等方面呢？

胡教授：已有大量的研究和临床实践证实，骨髓间充质或者基质细胞联合造血干细胞移植，更有利于造血干重建，但重建后血液系统疾病的复发、预后仍不能达到预期，尽管多种因素与此有关，但一个重要的考虑就是混合间充质或者基质细胞的使用。因为不同亚群的细胞，其对造血的调控作用，可能具有巨大差异。既然我们证实Sca1+、CD146+和CD166+亚群基质前体细胞对骨髓移植后造血重建支持存在差异，提醒我们使用间充质或者基质细胞联合造血干细胞移植时，有必要进行亚群选择，才能减低治疗风险，符合精准医学的要求。

生物通：下一步您的研究组还将进行哪些方面的研究呢？

胡教授：我们在前期研究的基础上，主要打算进行以下三个方面的深入探索：

（1）Sca1+、CD146+和CD166+亚群和其他小组报道的Niche构建细胞之间的关系
我们目前的研究，对Sca1+、CD146+和CD166+三种细胞进行了初步的界定，对nestin+、LeptinR+、CAR 等Niche构建细胞进行了初步的形态、基因比较，但是对于这些细胞之间的功能差异还未做出详细比对。把我们的研究，和其他小组证实的Niche构建细胞之间进行全面细致的比较，有助于更加准确的解析Niche构建机理，利于精准干预造血微环境。

（2）除调控造血外，Sca1+、CD146+和CD166+亚群的其他功能
我们研究的这些细胞，除了造血调控以外，能否直接参与免疫应答，是十分值得关注的研究热点。因为合理应用这些细胞，不得不充分考虑它们可能带来的免疫效应。事实上很多小组已经报道间充质或基质干细胞具有很强的免疫调控作用，但是各个亚群细胞如何参与免疫应答，还有待研究。

（3）人体中发挥Niche功能亚群的研究
小鼠虽然是很好的模式生物，但是和人体仍然存在到一定差异，比如细胞标记、数量等。目前关于Niche的大多数权威研究成果，数据多来自于小鼠或者其他模式动物，真正人类Niche的组成、构建等，还不清楚。我们所研究的Sca1+、CD146+和CD166+三种具有重要功能的细胞，在人类Niche中有相同标记的类似细胞？它们的功能是否完全相同？我们希望将来的探索，能够回答这些问题。

生物通：造血微环境研究逐渐成为了热点研究领域，您认为这一研究领域未来将会向哪些方面发展？

胡教授：目前造血微环境研究，主要集中在调控造血干细胞即HSC本身，而对于HSC向下分化到各系之后如髓系、淋巴系、巨核系、红系等阶段的研究比较少见，将来可能有更多的研究致力于回答造血各系如何受到Niche调控；由于技术手段的进展，造血微环境的研究才可能取得目前的发展与突破，科学家们在生理状态下将Niche的构建机理逐渐阐明之后，必然转到如何有效干预Niche的轨道上，为防治各类异常造血提供新策略；造血微环境理论和构建逐渐得到公认后，其他相关学科的微环境与研究也逐渐兴起，肿瘤微环境、神经干细胞微环境、生殖干细胞微环境、皮肤、毛发干细胞微环境、其他实体脏器干细胞微环境等，已经引起了研究者们的广泛关注，各种微环境生物学领域的高水平研究成果，正在逐年增加。

作者简介：

胡兴斌副教授是四川南充人，2000年本科毕业于第三军医大学，2009年获第四军医大学博士学位，2010-2012年在美国City of Hope医学中心贝克曼研究所造血干细胞和白血病研究室进行博士后研究。现任第四军医大学附属西京医院输血科副主任，副教授，副主任医师，硕士研究生导师，是ASH（美国血液学会）会员、ISBT（国际输血协会）会员，AABB（美国血库协会）会员，中华医学会临床输血分会青年委员，陕西省血液免疫专业委员会副主任委员，陕西省医学会临床输血青委会副主任委员。研究方向为造血微环境（Niche）的构建机理和功能，致力于通过解析Niche的形态建成过程，挖掘参与Niche构建的不同类型细胞的功能。先后承担和参与十余项项国家自然科学基金项目研究，在Hepatology、Cancer Research、JBC、FASEB J和Neoplasia等国际学术期刊发表SCI收录论著30余篇，被引400余次。获得过美国加州再生医学研究所（CIRM）博士后资助、国际输血医学发展中国家提名奖、陕西省科学技术一等奖。

原文摘要：Identification of a common mesenchymal stromal progenitor for the adult haematopoietic niche
Microenvironment cues received by haematopoietic stem cells (HSC) are important in regulating the choice between self-renewal and differentiation. On the basis of the differential expression of cell-surface markers, here we identify a mesenchymal stromal progenitor hierarchy, where CD45−Ter119−CD31−CD166−CD146−Sca1+(Sca1+) progenitors give rise to CD45−Ter119−CD31−CD166−CD146+(CD146+) intermediate and CD45−Ter119−CD31−CD166+CD146−(CD166+) mature osteo-progenitors. All three progenitors preserve HSC long-term multi-lineage reconstitution capability in vitro; however, their in vivo fates are different. Post-transplantation, CD146+ and CD166+ progenitors form bone only. While Sca1+ progenitors produce CD146+, CD166+ progenitors, osteocytes and CXCL12-producing stromal cells. Only Sca1+ progenitors are capable of homing back to the marrow post-intravenous infusion. Ablation of Sca1+ progenitors results in a decrease of all three progenitor populations as well as haematopoietic stem/progenitor cells. Moreover, suppressing production of KIT-ligand in Sca1+ progenitors inhibits their ability to support HSCs. Our results indicate that Sca1+ progenitors, through the generation of both osteogenic and stromal cells, provide a supportive environment for hematopoiesis.