CRISPR新应用：寻找基因调控元件

1月25日在《Nature Biotechnology》杂志发表的一项研究中，麻省理工学院（MIT）和哈佛医学院的研究人员描述了一种基于CRISPR的新技术，可系统而有效地在长的基因组片段中寻找调控元件。在这项技术的第一次应用过程中，他们发现了证据表明，当前人们对于基因调控的看法是不完整的。

　　

生物通报道：人体内所有的组织都是由蛋白质构成的，每一种蛋白质都是由人类基因组中一段DNA“编码”的。

但是这些编码区仅占基因组的大约百分之1，而分散在基因组中的其他百分之99的序列，参与了调节基因的表达，或决定哪些编码区将被翻译成蛋白质，以及何时被翻译。

1月25日在《Nature Biotechnology》杂志发表的一项研究中，麻省理工学院（MIT）和哈佛医学院的研究人员描述了一种新的技术，可系统而有效地在长的基因组片段中寻找调控元件。在这项技术的第一次应用过程中，他们发现了证据表明，当前人们对于基因调控的看法是不完整的。

本文资深作者、麻省理工学院电气工程和计算机科学教授David Gifford说：“传统的检测方法是将基因组切成小片段，并探讨它们是否足以推动基因的表达。这有两个局限性。第一，可能一些事情足以激活基因，但这并不意味着它是必要的。反之亦然：如果有什么事情是必要的，它可能就不是充足的。所以这些实验确实没有揭示关于基因组DNA功能的完整故事。”

Gifford补充说：“这些实验的另一个问题是，它们并不是在天然的背景下完成的。就是说，切割的DNA片段并不位于基因组中正常的位置。我们想用一种直接的检测法，揭示基因组序列在其原生环境中的必要性——在细胞中，它通常位于基因组中经常逗留的位置。我们就在它发挥正常作用的位置突变它。”

该研究的第一作者是Gifford课题组的博士后Nisha Rajagopal。哈佛医学院研究员Richard Sherwood是共同资深作者。

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未标记的路径
在最近几年，在基因组中确定调控元件的主要技术，一直是使用所谓的组蛋白标记。在细胞中，DNA通常被裹紧缠绕在组蛋白周围。组蛋白的末端经常有修饰——如乙酰基或甲基原子团的添加。

这些修饰是组蛋白标记，某些标记似乎与基因表达的抑制或促进有关。生物学家找到携带这些标记的组蛋白，切出缠在它们周围的DNA片段，并对DNA进行测序。当他们在基因组图谱中找到相应的序列时，他们就可以开始仔细地进行有针对性的实验，试图找出调控元件。

然而，麻省理工学院和哈佛大学的研究人员，已经确定了在基因调控中发挥关键作用的基因组区域，但之前这并没有与组蛋白标记联系起来。Gifford说：“科学总是经历一系列的假设。在我看来，这项研究表明，仔细考虑我们的假设，是很重要的。它没有直接反驳假设，但在一定意义上，要求我们对‘对基因组功能来说什么是必需的’做进一步的探索。”

Gifford及其研究小组开发的这项技术，是CRISPR基因编辑系统的一个应用。CRISPR是一种切割DNA的方法。在这篇新论文中，研究人员对四个已知蛋白编码区域中的每一个区域周围的数万个碱基对（或DNA字母），进行了彻底搜查。

RNA引导
为了定期进行切割，研究者设计了4000个引导RNA——将CRISPR切割酶引导到基因组中正确位置的生物小分子。

在实验中，引导RNA是在细胞内制造的。对于所有的引导RNA，研究人员构建了DNA模板，细胞可自然吸收。平均而言，每一个DNA模板在大约1000个细胞中显示出来。每个细胞都将一个DNA模板精确地转化为引导RNA，这引导着CRISPR切割酶到达基因组中的特定位置。

在每一个这样的位置上，CRISPR酶会切割DNA。当细胞试图修复那些切口时，修复部位的DNA序列会变得混乱。在某些情况下，这种干扰会阻止细胞制造相应的蛋白质，从而说明功能区域的重要性。

研究人员随后进行了一组实验，只靶定这些区域，以确定某些精确序列——其修饰会中断蛋白质的生产。在他们调查的四个蛋白质编码序列的每一段序列周围，他们发现了大约1000个碱基对的片段，它们显示出强烈的调控活性的迹象，但这些组蛋白标志以前没有描述过。

Gifford说，有可能是，这些片段仅存在于一小部分细胞中，并且，它们实际上与组蛋白标记有关；确定组蛋白修饰的标准技术，依赖于整个细胞群体的平均测量值，所以有可能错过了异常值。Gifford、Rajagopal及其同事正在继续调查这些区域，来确定它们当中发生了什么。

新年伊始，CRISPR技术的新应用可谓是如雨后春笋，例如，加州大学任兵教授带领的研究团队，开发了基于CRISPR/Cas9的高通量筛选策略，并由此发现了一类新型增强子。这项研究发表在一月二十六日的Genome Research杂志上（任兵教授利用CRISPR发现新型增强子）。而中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组，则首次利用CRISPR技术直接调控内源性基因表达，将胚胎干细胞分别诱导为胚外滋养层干细胞和原始内胚层细胞，成功实现早期胚胎细胞之间的谱系转换，研究结果发表于Nature子刊《Scientific Reports》（CRISPR技术实现早期干细胞谱系转换；赖良学教授连发CRISPR研究成果）。相信2016年将会是CRISPR技术继续大放异彩的一年。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
High-throughput mapping of regulatory DNA
Abstract：Quantifying the effects of cis-regulatory DNA on gene expression is a major challenge. Here, we present the multiplexed editing regulatory assay (MERA), a high-throughput CRISPR-Cas9–based approach that analyzes the functional impact of the regulatory genome in its native context. MERA tiles thousands of mutations across ~40 kb of cis-regulatory genomic space and uses knock-in green fluorescent protein (GFP) reporters to read out gene activity. Using this approach, we obtain quantitative information on the contribution of cis-regulatory regions to gene expression. We identify proximal and distal regulatory elements necessary for expression of four embryonic stem cell–specific genes. We show a consistent contribution of neighboring gene promoters to gene expression and identify unmarked regulatory elements (UREs) that control gene expression but do not have typical enhancer epigenetic or chromatin features. We compare thousands of functional and nonfunctional genotypes at a genomic location and identify the base pair–resolution functional motifs of regulatory elements.