新方法直接测定药物的靶点停留时间[创新技巧]

生物通报道 药物治疗的前提是它们与细胞靶点的物理结合。这种结合的测定往往是在体外进行，无法充分模拟细胞内的复杂环境。Promega的科学家近日开发出一种新方法，可直接评估活细胞内靶点作用的动态过程。这项成果于近日发表在《Nature Communications》期刊上。

阐释小分子调节剂如何与细胞内的靶点结合，对了解药理机制十分关键。除了靶点作用（target engagement）的特异性和亲和力，非平衡条件的结合动力学也决定了候选药物的治疗潜力。这些参数通常是通过生化方法来评估的，但无法充分模拟细胞内的复杂性。出于这个原因，制药行业一直希望在完整细胞内评估靶点作用。

Promega的科学家利用NanoLuc技术开发出一种新方法，可测定活细胞中的靶点停留（target residence），作为靶点作用的重要方面。这种技术利用生物发光共振能量转移（BRET），允许实时测定活细胞内药物与蛋白靶点的结合。

为了检测药物-靶点的相互作用，NanoBRET技术采用细胞通透性的荧光示踪剂，旨在与NanoLuc标记的蛋白靶点相互作用。这种相互作用的结果是NanoLuc蛋白的能量转移到示踪剂上，产生一种可测量的信号。

如果小分子候选药物与蛋白靶点相互作用，示踪剂就需要和药物竞争，这样BRET信号减弱。药物停留时间的测定依赖于化合物的预平衡、过量化合物的去除，以及示踪剂的添加。实时信号监测显示，缓慢解离的化合物阻碍示踪剂的结合，使得BRET信号缓慢产生。

直接测定靶点作用

在药物开发过程中，测定细胞中蛋白靶点与药物的结合并将这种靶点作用与药理作用相关联是十分重要的。NanoBRET技术为直接评估靶点作用提供了一种简单的方法。英国癌症研究中心曼彻斯特学院的Graeme Walker表示：“NanoBRET系统让我能够在活细胞中直接测定抑制剂的作用，我很期待将这种技术应用到其他靶点。”

测定靶点停留时间

NanoBRET技术一个更大的好处在于能够测定靶点停留时间，这是药物与蛋白相互作用的持续时间。这让研究人员能够优化药物，以便增强作用。Walker补充说：“NanoBRET技术在保持细胞完整的同时，采用一种简单的方法来测定化合物的停留时间。这种能力让我们团队能够阐释探针的新作用机制。”

NanoBRET技术是对BRET的大幅改良。它使用NanoLuc® 萤光素酶作为能量供体，而HaloTag® 蛋白标记的NanoBRET™ 618荧光基团作为能量受体，特别适合细胞水平蛋白相互作用的研究。【详细介绍请看：全新的蛋白相互作用分析工具：NanoBRET™技术】（生物通 余亮）

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原文检索

Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET

Nature Communications 6, Article number: 10091 doi:10.1038/ncomms10091