我科学家用CRISPR制备基因敲入猪

1月12日，来自中科院广州生物医药与健康研究院、吉林大学和云南农业大学的研究人员，在国际著名的综合性学术刊物《PLOS ONE》发表的一项研究中，通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，制备了携带Oct4-tdTomato报告基因的基因敲入猪。

　　

生物通报道：目前为止，科学家一直未能制备出可产生种系嵌合体的猪多能干细胞。基于Oct4启动子的荧光报告系统，可被用于监控多能性，是制备真正的猪多能干细胞的重要工具。1月12日，来自中科院广州生物医药与健康研究院、吉林大学和云南农业大学的研究人员，在国际著名的综合性学术刊物《PLOS ONE》发表题为“Generation of Knock-In Pigs Carrying Oct4-tdTomato Reporter through CRISPR/Cas9-Mediated Genome Engineering”的学术成果。在这项研究中，研究人员通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，制备了携带Oct4-tdTomato报告基因的基因敲入猪。中科院广州生物医药与健康研究院的赖良学、Qingjian Zou和云南农业大学的曾养志教授是本文共同通讯作者。延伸阅读：我学者用CRISPR让猪生产人血白蛋白。

转基因猪在农业和生物医药方面都有着广泛的应用。然而，生殖系有活性的猪多能干细胞（PSCs）目前尚未制备出来，这阻碍了猪模型的遗传修饰。为了解决这个问题，一种可能的解决办法是，为猪PSCs生成一种荧光报告系统。

转录因子Oct4，又名POU5F1，可维持细胞的多能性，因此，它的表达反映了干细胞多能性。猪的Oct4报告系统之前已有过报道。然而，关于“猪Oct4启动子的基因组结构”的知识还是有限的；因此，小鼠Oct4启动子被用来控制EGFP的表达，猪Oct4基因起始密码子上游（4000 bp）也被用来作为Oct4启动子。

小鼠Oct4启动子与猪转录调节因子不能很好地相互作用，4000 bp组成型启动子可能并不包含所有的调控元件。在猪当中，我们可通过随机地将外源报告载体整合到猪基因组中，构建基于小鼠或猪Oct4启动子的荧光报告系统。组成型表达载体中Oct4启动子不完全的监控区域，以及这些载体的不确定的整合位点，可能会影响其调节功能的准确性。此外，拷贝数变化和内源性基因破坏的风险，可能会进一步影响报告基因的表达。将一个报告基因精确插入内源Oct4的框架，可允许内源性启动子诱导的报告基因表达，而不改变内源性Oct4的表达，从而可提高猪Oct4表达模拟的精度。

点击获取干细胞高效ViaFect™转染试剂资料

将外源基因敲入猪体细胞的基因组中，一直都是极为困难的，因为传统的同源重组（HR）效率极低。最近发展起来的CRISPR/Cas9系统，可在合成的单导向RNA（sgRNA）的辅助下，用简单的碱基互补，靶定和编辑特定的基因组位点。该CRISPR/Cas9系统已用于编辑各种生物的基因组，包括原核生物和真核生物。序列特异性核酸酶能有效地在DNA中产生双链断裂，并通过同源指导修复显著增加HR的效率。

在这项研究中，研究人员构建了一个猪Oct4的报告系统，其中内源性Oct4启动子可直接控制红色荧光蛋白（RFP）。通过同源重组（HR），研究人员将2A-tdTomato序列插入并替换猪Oct4基因的终止密码子。因此，荧光能准确地显示内源性Oct4的激活。利用CRISPR/Cas9系统，研究人员获得了在内源性Oct4基因启动子下游具有tdTomato基因敲入的猪胎儿成纤维细胞（PFF）系。转基因的PFFs可被用作体细胞核移植（SCNT）的供体细胞。

研究人员在SCNT胎儿的囊胚和生殖嵴中，检测到了强大的RFP表达。通过SCNT，研究人员也制备了两只有生活力的转基因猪。通过另一轮SCNT对来自胎儿和仔猪的成纤维细胞进行重编程，可导致重构囊胚中的tdTomato再激活。结果表明，监测细胞多能性状态的一个KI猪报告系统，已被成功构建。

（生物通：王英）

注：赖良学教授,现任中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员。中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员，吉林大学畜牧兽医学院院长/教授，博士生导师，华南干细胞与再生医学研究所副所长。2013年获得第四届振兴中国畜牧贡献奖十大杰出人物。主要研究领域：人和动物胚胎干细胞的分离培养、转基因动物的建立、动物克隆及人类治疗性克隆、体外受精及其影响因素。先后在《Science》、《Nature Biotechnology》等国际影响力期刊上发表论文多篇，获得国家级、省级专利多项。

曾养志，动物遗传学，教授，云南农业大学版纳微型猪近交系研究所所长。云南省版纳微型猪近交系重点实验室主任。1964年毕业于云南农业大学动物科学技术学院。毕业后留校工作，从事教学及科研管理。1980年开始我国第一个微型猪近交系的培育,采用国际上从未采用过的连续高度近交和严格选择的科学方法，克服了早期世代中出现的严重近交衰退现象，经过24年的培育，2003年已进入20世代，近交系数高达98.6%，培育成功两个体型大小不同、基因型各异的近交系，近交系下又进一步分化为5个家系和具有不同表型和遗传标记的18个亚系。2005年已通过科技成果鉴定，版纳微型猪近交系的培育成功，为生物医学研究、异种器官移植和转基因动物研究提供了基因高度纯合、遗传背景清楚而又性状各异的大型哺乳动物近交纯系动物。

生物通推荐原文摘要：
Generation of Knock-In Pigs Carrying Oct4-tdTomato Reporter through CRISPR/Cas9-Mediated Genome Engineering
Abstract: The porcine pluripotent cells that can generate germline chimeras have not been developed. The Oct4 promoter-based fluorescent reporter system, which can be used to monitor pluripotency, is an important tool to generate authentic porcine pluripotent cells. In this study, we established a porcine Oct4 reporter system, wherein the endogenous Oct4 promoter directly controls red fluorescent protein (RFP). 2A-tdTomato sequence was inserted to replace the stop codon of the porcine Oct4 gene by homogenous recombination (HR). Thus, the fluorescence can accurately show the activation of endogenous Oct4. Porcine fetal fibroblast (PFF) lines with knock-in (KI) of the tdTomato gene in the downstream of endogenous Oct4 promoter were achieved using the CRISPR/CAS9 system. Transgenic PFFs were used as donor cells for somatic cell nuclear transfer (SCNT). Strong RFP expression was detected in the blastocysts and genital ridges of SCNT fetuses but not in other tissues. Two viable transgenic piglets were also produced by SCNT. Reprogramming of fibroblasts from the fetuses and piglets by another round of SCNT resulted in tdTomato reactivation in reconstructed blastocysts. Result indicated that a KI porcine reporter system to monitor the pluripotent status of cells was successfully developed.